WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |   ...   | 12 |

N. albus ВКМАс-805Т. Продукты кислотного гидролизаклеточных стенок и препарата ТК из нихсвидетельствовали о наличии ТКглицерофосфатной природы (табл. 1), имеющейзаместители (обнаружены галактоза, глюкозаи пировиноградная кислота). Отсутствиесреди них дифосфата глицерина иобнаружение в щелочных гидролизатах лишьмонофосфорного эфира глицерина (Э1)указывало наполи(гликозилглицерофосфатную) природу ТК(табл.1). Эфир Э1состоял из монофосфата глицерина,галактозы, глюкозы и пировинограднойкислоты в эквимолярном количестве.Вероятно, Э1 являлся основнымповторяющимся звеном ТК. Полная структураполимера была установленаЯМР-спектроскопическими методами. Сигналыпри 70,6-72,2 и 67,85 м.д. были типичными длярезонанса С1 и С3 глицериновых остатков вспектре поли(гликозилглицерофосфатной)цепи с гликозильными заместителями при С1глицерина (Naumova et al., 1990). Сигналы при 25,9(СН3-С), 101,9 (О-С-О) и 174,7 м.д.(С=О) были идентифицированы какпринадлежащие остатку пировинограднойкислоты, локализованному в положениях 4,6пиранозы (Шашков и др., 1992). Сигналы при 22,0 и176,7 м.д. принадлежали О-ацетильным группам. Сигнал малойинтенсивности при 109,1 м.д. обнаруживалприсутствие -галактозы в фуранознойконфигурации (Bock and Pedersen, 1983). Спектрывыявили присутствие -галакто- и -глюкопираноз как главныхуглеводных компонентов полимера. Былоопределено также, что -галактофуранозаявляется минорным сахарным компонентомполимера, соотношение -Galpи -Galfсоставляет 7:1(рассчитано по интенсивности сигналов при104,2 + 102,5 м.д. и 109,1 м.д.). Таким образом,основная повторяющаяся единица полимераимеет следующую структуру:

OAc(0,5)

2

-3)--D-Galp-(11)-snGro-(3-P-

4

-D-Glcp(4,6Pyr)-1

-галактопиранозильные остаткиО-ацетилированы по гидроксилу при С2примерно на 50%. Остаток -галактофуранозы,вероятно, является терминальным нарастущем конце цепи полимера и служитсигналом для прекращения его роста.Возможность существованиягалактофуранозного -1,6-связанного олигомера на концецепи подтверждается анализом ТК изклеточной стенки N. luteus другого вида этого рода. ТКуказанной структуры обнаружена впервые(Шашков и др., 1999; Tul’skaya et al., 2003).

N. luteus ВКМАс-1246Т и 12других штаммов с идентичной ТК. Профиль продуктов кислотногогидролиза клеточной стенки и ТК из неёуказывал на наличие ТКполи(рибитфосфатной) природы с галактозойи пировиноградной кислотой в качествезаместителей (табл. 1). Среди продуктовHF-гидролиза ТК был выявлен гликозид Г1 иидентифицирован как галактозилглицерин.При щелочном гидролизе, кроме фосфорныхэфиров рибита (табл.1), найдены эфиры Э1(основной) и Э2 (минорный, подробно неизучен), имеющие одинаковый качественныйсостав. Э1 был монофосфатомгалактозилрибита с пировинограднойкислотой. Локализация фосфодиэфирныхсвязей и пировиноградной кислоты, наличиеО-ацетильныхгрупп (20%) пригидроксилах по С3 рибита, конфигурациягликозидной связи и ее положениеустановлены с помощью ЯМР-спектроскопии,кроме того, было показано наличие -1,6-связанногоолигомера, состоящего из 6 остатковгалактофуранозы (соотношение Galp:Galfсоставляло 3(5) :1). Молекулярная масса ТК составила 8,6-8,9 кДа,что соответствовало 18-ти повторяющимсязвеньям.

-1-Rbo-5-P-

4

-D-Galp(4,6Pyr)-1

ТК данной структурыобнаружена впервые (Шашков и др., 2000 ;Tul’skaya et al., 2003):

«N. albus».ВКМ Ас-806. В клеточных стенкахэтого штамма с использованием химических иЯМР-спектроскопических методов былиобнаружены как минимум две ТК. ТК1 – такая же поструктуре как и в N. luteus,однако соотношение Galp:Galfсоставляло 1 : 1,и ТК2 – полимерполи(рибитфосфатной) природы с рамнозой вкачестве заместителя (Tul’skaya et al., 2003).

5.4. Структуры анионныхполимеров клеточных стенок некоторыхвидов рода Streptomyces

К началу нашихисследований наибольшее количество ТКбыло изучено именно у представителей родаStreptomyces(Наумова, Шашков, 1997), относящихся кразличным филогенетическим ифенотипическим группам. В настоящей работебыли исследованы представители близкихвидов этого рода.

S. castelarensis ВКМАс-832Т (ранееS. rutgersensis ssp. сastelarensis). В кислотных гидролизатахклеточной стенки и препарата анионныхполимеров из нее обнаружен глицерин и егофосфорные эфиры, глюкозамин, лизин,галактоза. Разделение в электрическом полепрепарата полимеров, выделенном изклеточной стенки, выявило двефосфорсодержащие зоны, чтосвидетельствовало о наличии как минимумдвух ТКполи(глицерофосфатной) природы. Былопредпринято дробное выделение полимеровиз целого обезжиренного мицелия споследующим дробным осаждением 96%-нымэтанолом и очисткой методом переосажденияв ледяной воде. Это позволило получитьпрепараты, преимущественно содержащие туили другую ТК. Дополнительную очистку ТКосуществляли методом ионообменнойхроматографии на DEAE-Toyopearl 650M в линейномградиенте NaCl.

Препарат 1, имеющийэлектрофоретическую подвижность mGroP 1,2-1,3, при кислотноми щелочном гидролизах дал продукты,характерные для незамещеннойглицеринтейхоевой кислоты 1,3-типа (табл. 1).Мольное соотношение фосфор – глицерин было 1 : 1.Следовало иметь ввиду присутствие в этомпрепарате незамещенного2,3-поли(глицерофосфата), так как последнийдает аналогичные результаты при егохимических исследованиях, за исключениемдиглицеринтрифосфата при щелочномгидролизе. Вопрос был решенЯМР-спектроскопическими методами.

Препарат 2, сэлектрофоретической подвижностью mGroP 0,9, в составекислотных гидролизатов имел глицерин и егофосфорные эфиры, глюкозамин и лизин.HF-гидролиз препарата 2 привел к образованиюдвух гликозидов: Г1 – GlcpNAc-(12)-snGro и Г2 – GlcpNН-(12)-snGro и фрагмента цепи ТК – Lys-(12)-Gro. Эти данные всовокупности с результатами изученияпродуктов щелочного гидролиза препарата 2,среди которых были найдены двафосфодиэфира глицерина с глюкозамином,причем лишь один из фосфодиэфиров былнингидрин положительным, привели кпредположению, что ТК из этого препаратаявляется 1,3-поли(глицерофосфатом) частичнозамещенным глюкозамином, только частьостатков которого ацетилирована.Молекулярная масса этой ТК составила 6,0кДа, что соответствует ~25 глицерофосфатнымединицам.

Независимо обапрепарата были исследованы методомЯМР-спектроскопии. В результатехимическими и ЯМР-спектроскопическимиисследованиями удалось установить, чтоклеточная стенка S.castelarensis ВКМ Ас-832Т содержит наборразличных ТК. Минорные – незамещенные 1,3- и2,3-поли(глицерофосфаты), основная –1,3-поли(глицерофосфат), треть мономеровимеет по гидроксилам при С2 глицеринаглюкозаминильные остатки, только частькоторых N-ацетилирована. ТК такой структурынайдена впервые (Tul’skaya etal., 1991).

S. melanosporofaciens ВКМ Ас-1864Т, S. hygroscopicus ВКМ Ас-831Т, S. violaceusniger ВКМ Ас-583Т, S. endus ВКМ Ас-1331Т, S. endus ВКМ Ас-129. Продукты кислотного и щелочногогидролизов клеточных стенок и суммарныхпрепаратов из них свидетельствовали (табл.1) о присутствии 1,3-поли(глицерофосфата), аобнаруженные галактозаи глюкозамин – что ТК, замещенасахарными остатками. Электрофорез выявилтри фракции, которые были накопленыметодом препаративногоэлектрофореза, элюированы, лиофилизованы иисследованы отдельно.

Фракция 1 (mGroP 1,3-1,4) представляласобой, скорее всего, смесь свободных 1,3- и2,3-поли(глицерофосфатных) цепей (Тульская идр., 1997), о чем свидетельствовали продуктыее кислотного и щелочного гидролизов (табл.1). Фракция 2 (основная ТК, mGroP 0,82-0,9) – идентифицированы1,3-поли(глицерофосфатные) цепи, частичнозамещенные -глюкозамином, причем частьглюкозаминильных остатков N-ацетилированав той или иной степени (кроме штамма Ас-1864Т, в ТК которого всеглюкозаминильные остатки N-ацетилированы).В продуктах деградации основной ТК изS. hygroscopicus, S. endus Ас-1331Т иАс-129, S. violaceusnigerс помощью гидроксамовой реакции былиобнаружены О-ацетильные остатки. Фракция 3 имелаэлектрофоретическую подвижность mGroP 0,3 и окрашиваласьреактивом Ишервуда в серый цвет. Прикислотном гидролизе обнаружена галактоза,а также в следовом количестве продуктыдеградации ТК из фракции 2 – этосвидетельствовало о том, что последняя небыла основным компонентом этойфракции.

Суммарные препаратыклеточных стенок каждого исследуемогострептомицета были изучены методамиЯМР-спектроскопии. Эти исследованияподтвердили предварительныепредположения, основанные на химическихметодах. Таким образом, клеточные стенкиисследуемых стрептомицетов содержалиодновременно четыре анионныхуглеводсодержащих полимера. Три ТК: незамещенные 1,3- и2,3-поли(глицерофосфаты) и1,3-поли(глицерофосфат) с большей илименьшей степенью замещения остатками-глюкозамина,часть которых N-ацетилирована (табл. 6).Четвертый –обнаруженный впервые вприроде полимер Kdn, замещенный -Galp,состоящий ~ из 20 мономерных звеньев(Тульская и др.. 2007а).

Итак, ТК данной группыстрептомицетов были аналогичны таковым уS. castelarensis ВКМАс-832Т, а в клеточныхстенках последнего была также найденагалактоза, поэтому было предпринятоповторное исследование препаратовполимеров этого штамма на предметобнаружения полимера Kdn. В результатеметодами ЯМР-спектроскопии в препаратах изклеточной стенки S. castelarensisтакже был идентифицирован полимер Kdn той жеструктуры, что и у вышеупомянутых штаммов(Тульская и др.. 2007а).

S. sparsogenesВКМ Ас-1744Т. Профили кислотного ищелочного гидролизов клеточной стенки ипрепарата ТК свидетельствовали (табл. 1) оприсутствии полностью замещеннойгликозильными заместителямиполи(глицерофосфатной) цепи 1,3-типа. Вкачестве гликозильных заместителей быливыявлены глюкозамин, галактозамин иглюкоза. Дополнительная информация былаполучена при изучении продуктов гидролизаТК 47%-ной HF. Идентифицировано двасоединения. Соединение 1 было идентичноGlcpNAc-(12)-snGro, полученномунами ранее из ТК2 S.castelarensis. Соединение 2содержало галактозамин и глюкозу.ЯМР-спектроскопические исследованияпрепарата из клеточной стенки и соединения2 позволили установить повторяющуюсяединицу основной ТК:

-D-Glcp-(13)--D-GalpNAc-(13)--D-GalpNAc-(16)--D-GlcpNAc-1

2

-1)-sn-Gro-(3-P-

ТК такой структурыобнаружена впервые (Шашков и др., 1998). Электрофорезвыявил присутствие минимум двух ТК вклеточной стенке стрептомицета: кроме основной ТКобнаружено минорное количествонезамещенного 1,3-поли(глицерофосфата), чтобыло подтверждено ЯМР-спектроскопическимисследованием. Молекулярная массаосновной ТК составила 9,8 кДа, чтосоответствует приблизительно 11повторяющимся звеньям.

Streptomyces sp.ВКМ Ас-2274 (=МБ-8). Продуктыкислотного и щелочного гидролизовклеточной стенки и ТХУ-препарата указывалина присутствие 1,3-поли(глицерофосфатныхцепей), табл. 1, а обнаружение галактозы,3-О-метилгалактозы (мадурозы), глюкозаминапредполагало, что либо эти сахаридыявляются заместителями в молекуле ТК, либоони образуют некий гликополимер.ТХУ-препарат в электрическом полеразделился на три фракции, которые былинакоплены и исследованы отдельно.

Фракция 1 (минорная,mGroP 1,3). При кислотномгидролизе идентифицированы моно-,бисфосфаты глицерина и неорганическийфосфат. Образование таких же продуктов, атакже диглицеринтрифосфатапри щелочном гидролизе моглосвидетельствовать о том, что фракция1–незамещенный 1,3-поли(глицерофосфат) (Kelemen andBaddiley, 1961). Фракция 2 (основная, mGroP0,82). После кислотногогидролиза обнаруживались глицерин, егомоно- и бисфосфаты, неорганический фосфат иглюкозамин. Изучение продуктов HF- (гликозидГ1) и щелочного гидролизов (фосфодиэфир Э1)привело к предположению, что ТК этойфракции –1,3-поли(глицерофосфат), частично замещенный-N-ацетилглюкозамином. Фракция 3(mGroP 0,56).Окрашивалась реактивом Ишервуда в серыйцвет. Кислотный гидролиз привел кобразованию, галактозы, 3-O-метилгалактозы,а также следовых количеств продуктовдеградации ТК из фракции 2. Следовательно,ТК не являлась основным полимером этойфракции.

Суммарный препаратполимеров, а также фракции 2 и 3 исследовалиЯМР-спектроскопическими методами, крометого, фракция 3 была подвергнута MALDI TOFмасс-спектроскопическому анализу. Врезультате проведенных исследованийоказалось, что клеточная стенкаисследуемого стрептомицета содержит всвоем составе две ТК. Основная –1,3-поли(глицерофосфат), на 60% замещенный-D-N-ацетилглюкозамином; минорная–незамещенный 1,3-поли(глицерофосфат). Крометого –олигомер 3-дезокси-D-глицеро-D-галакто-нон-2-улопиранозоновой кислоты (Kdn),имеющий следующую структуру:

(-D-Galp3OMe)-D-Galp-11--D-Galp3OMe (-D-Galp)

99

-Kdn-(24)--Kdn

Кислый олигосахаридтакой структуры обнаружен впервые(Shashkov et al., 2002).

Streptomyces sp.МБ-2, МБ-5, МБ-6, МБ-7, МБ-10. Вкислотных гидролизатах клеточных стенокбыли идентифицированы рибит, его моно- ибисфосфаты, ангидрорибитфосфат,неорганический фосфат, ангидрорибит,глюкоза, галактозамин, пировинограднаякислота (для трех штаммов: МБ-2, МБ-5, МБ-6), атакже неидентифицированноенингидрин-положительное соединение.Кислотный гидролизат суммарных препаратовиз клеточных стенок этих стрептомицетовсодержал тот же набор продуктов. Однакоколичество глюкозы было бльшим, чемколичество рибитфосфата во всех случаях,кроме МВ-5. Полученные данные однозначносвидетельствовали о наличиирибиттейхоевой кислоты с глюкозой всоставе суммарных препаратов, и неисключали присутствия полимеров иногостроения, в структуру которых также входитглюкоза. Таким образом, можно былопредположить, что эти организмы содержат вклеточных стенках похожий набор анионныхполимеров. Электрофорез суммарныхпрепаратов из каждого организма вотдельности выявил несколько фракций,которые были накоплены методомпрепаративного электрофореза, элюированы,лиофилизированы и исследованы отдельно.

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |   ...   | 12 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»