WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 12 |

N. synnemataformans Ас-2518Т.Продукты кислотного и щелочногогидролизов клеточных стенок и препаратовТК были аналогичны таковым для N. dassonvillei ssp. dassonvillei. Среди них были характерный эфир Э3. Это позволило предположить, чтопрепарат из клеточной стенки N. synnemataformans Ас-2518Тсодержит ТК идентичную таковой из N. dassonvillei ssp. dassonvillei.Предположение было подтвержденоЯМР-спектроскопическими методами анализа.Однако анализ одномерного 31Р ЯМР-спектра икорреляционных пиков в двумерном 1Н,31Р HМQC спектреобнаружили отличия в структурныхфрагментах, содержащих фосфор: -1)-snGro-(3-P-3)--GalpNAc-(1 и -1)-snGro-(3-P-4)--GalpNAc-(1.

Таким образом, вклеточной стенке N.synnemataformans Ас-2518Тобнаружены две ТК: основная – поли(глицерофосфат--N-ацетилгалактозаминилглицерофосфат),такая же как у N. dassonvillei ssp. dassonvillei и минорная – поли(глицерофосфат--N-ацетилгалактозаминилглицерофосфат),в которой фосфодиэфирная связьосуществляется по гидроксилам при С3глицерина и С4 -N-ацетилгалактозамина, причём цепьне несёт никаких заместителей; ТК такойструктуры (рис. 6 б) обнаружена впервые (Tul’skaya et al., 2007).

N. halotoleransАс-2519Т. Профили кислотного и щелочногогидролизов клеточной стенки и препарата ТКиз нее соответствовали таковым для N. synnemataformans Ас-2518Т.Кроме того, была идентифицированапировиноградная кислота. Таким образом,можно было предположить, что и в данномслучае имеем дело с ТК, подобной таковой изN. dassonvilleissp. dassonvillei.Некоторую неясность вносило наличиепировиноградной кислоты. Локализоватьфосфодиэфирные связи, а также местоприсоединения пировиноградной кислотыудалось лишь с помощьюЯМР-спектроскопических методов.

Характернойособенностью спектра ЯМР 13С препарата былоналичие в нем пиков с химическими сдвигами26,2 м.д. (СН3группа согласно АРТ) и 174,2 м.д. (С=О), что сучетом сигнала при 100,2 м.д., принадлежащегочетвертичному атому углерода (тест начисло присоединенных протонов, АРТ, Patt andShoolery, 1982), позволяло предположить наличиепируватных остатков в полимере. В спектреЯМР 13С сигналыодного из остатков -GalpNAcимели химические сдвиги С4 и С6 отличные отсоответствующего остатка со свободнымигидроксилами при С4 и С6. Эти отличия былихарактерными для замещения остаткапируватом по С4 и С6 (Jansson et al, 1993), чтопозволяло локализовать пируватнуюгруппировку при соответствующих атомахуглерода в части остатков -GalpNAc полимерной цепипрепарата. Химический сдвиг 13С метильной группыпируватного остатка (26,2 м.д.)свидетельствовал об экваториальнойориентации метильной группы вшестичленном 4,6-ацетальном цикле (R-конфигурацияацетального центра). Анализ двумерныхспектров ЯМР, включая спектр 1Н,31Р HМQC показал, чтобольшая часть (90%) остатков -GalpNAc-4,6-R-Pyr имеют фосфатнуюгруппу по гидроксилу при С3, остальныеостатки, находящиеся, по-видимому, нарастущем конце цепи, несут при С3 свободныйгидроксил. Помимо перечисленныхструктурных фрагментов в препаратеобнаружены фрагменты с -GalpNAc, несущей фосфатныегруппы по гидроксилам при С4 и С3, но безпируватной группировки в последней.Приблизительное соотношение остатков спируватом -Р-3)--GalpNAc-4,6-R-Pyrи без пирувата -Р-3)--GalpNAc,найденное по интегральным интенсивностямсоответствующих сигналов в спектре ЯМР13С, составляло3,5 : 1.Соотношение остатков с фосфатнойгруппировкой по гидроксилам при С3 и С4-N-ацетилгалактозамина определенокак 10,5 : 1.

Таким образом, вклеточной стенке N.halotolerans Ас-2519Т обнаружены двеТК. Основнаяполи(глицерофосфат--N-ацетилгалактозаминилглицерофосфат),с пировиноградной кислотой по гидроксилампри С4,6 галактозамина. ТК такой структурынайдена впервые. Минорная – соответствовалатаковой из N. synnemataformans Ас-2518Т(рис. 6 в, Tul’skayaet al., 2007).

N. alba ВКМАс-1883Т, ВКМАс-1879 и ВКМ Ас-1884. Результатыизучения структур ТК трех штаммовактиномицетов вида N.alba были идентичны для всехтрех штаммов за исключением некоторыхколичественных отличий. Кислотныегидролизаты препаратов содержалиглицерин, рибит, фосфорные эфиры этихполиолов и глюкозамин, что позволилопредположить присутствие нескольких ТК. Наэто указывали данные электрофоретическогоисследования препаратов: были обнаружены трифосфорсодержащие зоны с подвижностью:фракция I –mGroP 1,4; фракцияII – mGroP 1,57; фракция III– mGroP 1,96. Очистку иразделение ТК, выделенных из обезжиренногомицелия, осуществляли методомионообменной хроматографии на DEAE-Toyopearl 650M.Были получены три фракции, содержащиефосфор (рис. 2).

Рис.2. Ионообменнаяхроматография препарата ТК клеточнойстенки N. albaАс-1879 на DEAE Toyopearl 650M в линейном градиенте NaCl(00,5 М) в 50 мМTris-HCl-буфере, рН 7,2 (колонка 16.5х500 мм;скорость протока 2 мл/мин; объем фракции 4мл); I, II, III фракции тейхоевых кислот

Фракция I, элюированапри 0,16–0,19 М NaCl.Продукты кислотной и щелочной деградацииуказывали на поли(рибитфосфатную) природуТК1 без заместителей (табл. 1). Припериодатном окислении ТК1 образовалсяформальдегид в эквимольном

Рис. 3. Определениемолекулярной массы ТК клеточной стенкиN. alba (сефадексG-50, колонка 9909,5 мм; объем фракции 2 мл).Стандартные вещества: (1) –ТК Streptomyces antibioticus, 7,0 кДа(Shashkov et al., 1979); (2) – ТК S. violaceus, 4,0 кДа (Наумова и др., 1969); (3) – ТК S.azureus, 3,3 кДа (Стрешинская и др.,1981); (4) –монофосфат глицерина; – ТК1; –ТК2; – ТК3

отношении к фосфору, чтоуказывало на необычное положениефосфодиэфирной связи. Исходя из имеющихсяданных о биосинтезе ТК [отсоответствующего нуклеотида к растущейцепи переносится D-рибит-5-фосфат (Baddiley, 1972)],в образовании фосфодиэфирной связи должнаучаствовать гидроксильная группа при С5рибита. Тогда вторая гидроксильная группа,участвующая в образовании фосфодиэфирнойсвязи, находится при С3 рибита.Молекулярная масса полимера составила 5,6кДа (рис. 3), соответственно, цепь полимерасостояла из 26-27 рибитфосфатных звеньев.Предполагаемая структура подтвержденаметодами ЯМР-спектроскопии. Таким образом,ТК 1 представляла собой незамещенный3,5-поли(рибитфосфат) и являлась новойструктурой, рис. 6 ж, (Tul’skayaet al., 1995).

Фракция II, элюированапри 0,22 М NaCl. Профили кислотного и щелочногогидролизов фракции указывали наполи(глицерофосфатную) природу ТК2 (табл. 1),в состав которой в качестве заместителявходит глюкозамин. В HF-гидролизатах ТК2обнаружен гликозид, идентифицированный как GlcpNAc-(12)-snGro. Учитываяструктуру гликозида, а также фактобразования при щелочном гидролизеполимера щелочестабильных фосфодиэфировглицерина, был сделан вывод, что ТК2является 1,3-поли(глицерофосфатом), вкотором часть глицериновых остатковзамещена N-ацетилглюкозамином.Молекулярная масса ТК2 составляла 7,6 кДа,что соответствует, исходя из мольногосодержания компонентов полимера, 40-41глицерофосфатному звену (рис. 3). Спектр13С-ЯМР ТК2 былтипичным для замещенного на 10% -N-ацетилглюкозамином1,3-поли(глицерофосфата), рис. 6 з, (Tul’skaya et al., 1995).

Фракция III, элюированапри высокой концентрации NaCl (~ 0,3 М). Этоуказывало на бльший отрицательный заряд ТК3 изэтой фракции, чем у ТК1 и ТК2 (рис. 2), чтоподтверждадено высокой подвижностью ТК3 вэлектрическом поле (mGroP 1,96). Продуктыкислотного гидролиза свидетельствовали ополи(рибитфосфатной) природе ТК3 (табл. 1), аидентифицированная при этомпировиноградная кислота, видимо, являласьзаместителем в молекуле изучаемой ТК.Устойчивость ТК3 к действию щелочисвидетельствовала об отсутствии свободныхгидроксильных групп, соседних сфосфодиэфирными группами (Kelemen and Baddiley, 1961),а устойчивость к периодатному окислениюуказывала на отсутствие в полимеренезамещенных гликольных группировок.Можно было предположить, что рибитныеостатки замещены пировинограднойкислотой, связанной кетальной связью,которая стабильна в щелочных условиях (Thurowet al., 1975). Молекулярная масса ТК3 составляла5,4 кДа, что соответствует примерно 18повторяющимся звеньям (рис. 3).

ЯМР-спектроскопическоеисследование подтвердило предполагаемуюструктуру:1,5-поли(рибитфосфат) полностью замещенныйпо гидроксилам при С2,4 рибита кетальносвязанной пировиноградной кислотой (рис. 6и). ТК такой структуры выявленавпервые (Tul’skayaet al., 1995).

Соотношения найденныхТК в клеточных стенках трех изучаемыхштаммов, установленные при количественномопределении глицерина и рибита в них сучетом полного замещения рибитныхостатков пировиноградной кислотой в ТК3,разные. Является ли этот факт штаммовымпризнаком –предмет дальнейших исследований набольшей выборке штаммов одного вида.

N. prasina ВКМАс-1880Т. В кислотных гидролизатах клеточнойстенки и ТХУ-препарата обнаруженыфосфорные эфиры глицерина и рибита, чтомогло свидетельствовать о присутствиинескольких ТК. Разделение и очистку ТК,выделенной из целого обезжиренногомицелия, осуществляли с помощью методаионообменной хроматографии на DEAE-Toyopearl 650M.Были получены две фосфорсодержащиефракции.

ТК из фракции I(элюирована при 0,17 М NaCl) и фракции II(элюирована при 0,22 М NaCl) соответствовалитаковым из клеточных стенок N. alba, что былоподтверждено химическими иЯМР-спектроскопическими методамиисследования (рис. 6 ж, з). ТК1 представляласобой незамещенный 3,5-поли(рибитфосфат), нос бльшеймолекулярной массой 9,4 кДа, что соответствует 41рибитфосфатной единице. ТК2 являлась1,3-поли(глицерофосфатом), на 10% замещенным-N-ацетилглюкозамином и на 5% О-ацетильнымиостатками, последнее, также как и несколькомньшаямолекулярная масса (6,0 кДа, чтосоответствовало 33 глицерофосфатнымединицам), отличало эту ТК от ТК2 из N. alba (Тульская и др.,2000).

N. composta ВКМАс-2520 и N. composta ВКМ Ас-2521T. Продукты кислотного и щелочногогидролизов клеточных стенок этихорганизмов, также как и препаратов ТК изних свидетельствовали о глицерофосфатнойприроде ТК (табл. 1), замещеннойглюкозамином. Образовавшиеся приHF-гидролизе гликозид, идентифицированныйкак GlcpNAc-(12)-snGro, а при щелочном гидролизефосфодиэфир глицерина сN-ацетилглюкозамином, указывали, что данныеТК являются 1,3-поли(глицерофосфатами),замещёнными глюкозамином, что былоподтверждено ЯМР-спектроскопическимиметодами. По интегральной интенсивностисигналов концевых и срединных остатковдлина 1,3-поли(глицерофосфатной) цепи былаоценена в 10 единиц.

Итак, клеточные стенкиN. compostа ВКМАс-2520 и N. compostа ВКМ Ас-2521T содержали единственную ТК –1,3-поли(глицерофосфат), на 10% замещённый-N-ацетилглюкозамином (Tul’skaya et al., 2007).

N. metallica ВКМ Ас-2522T. В кислотныхгидролизатах клеточных стенок и препаратаТК найдены фосфорные эфиры рибита,пировиноградная кислота, а также внебольшом количестве фосфорные эфирыглицерина. Это указывало на возможноеприсутствие нескольких ТК, чтоподтверждали данные электрофоретическогоисследования:обнаружены две фосфорсодержащие зоны сподвижностью I mGroP 0,93 и II mGroP 1,27. Препарат из клеточной стенкибыл подвергнут ЯМР-спектроскопическимисследованиям.

Основные сигналыспектра ЯМР 13Спрепарата были идентифицированы какпринадлежащие 1,5-поли(рибитфосфату) с2,4-пируват-кетальными заместителями.Минорные сигналы в спектре принадлежалиполимеру с 1,3-поли(глицерофосфатными)цепями, где часть (30%) глицериновых остатковзамещена по гидроксилу у С-2 остатками-GlcpNAc. Мольноесоотношение основного и минорногополимеров оценено как 7,5 : 1.

Итак, клеточная стенкаN. metallica ВКМАс-2522Tсодержала две ТК. Основная –1,5-поли(рибитфосфат), каждая рибитфосфатнаяединица которого несёт 2,4-кетальносвязанную пировиноградную кислоту иминорная –1,3-поли(глицерофосфат) на 30% замещённый-N-ацетилглюкозамином, рис. 6 з, и(Tul’skaya et al.,2007).

N. trehalosi ВКМ Ас-942. В продуктахкислотного гидролиза клеточной стенки и ТКиз нее кроме фосфорных эфиров глицеринабыла обнаружена глюкоза. Полимер частичногидролизовался щелочью с образованиемнебольшого количества моно- и бисфосфатовглицерина. Молекулярная масса полимерасоставила около 8,0 кДа, что соответствуетприблизительно 40 глицерофосфатнымзвеньям.

В 13С ЯМР-спектрах ТК идентифицированывсе сигналы, характерные для1,3-поли(глицерофосфата) на 60%замещенного -глюкозильными остатками, рис. 6 д,(Стрешинская и др., 1998).

5.2. Структуры тейхоевыхкислот клеточных стенок видов рода Glycomyces

В настоящем разделеприведены структуры ТК клеточных стенок 4-хштаммов, принадлежащих двум валидноописанным видам (Labeda et al., 1985) рода Glycomyces, установленныенами.

G. rutgersensis ВКМ Ас-1248. Профилькислотного гидролиза клеточной стенки и ТК(табл. 1) соответствовал наличиюполи(глицерофосфата), а обнаружение вгидролизатах глюкозы предполагалозамещение остатков глицерина этим сахаром.ТК была полностью устойчива к щелочномугидролизу, что указывало на полноезамещение полимера глюкозой. В продуктахHF-гидролиза идентифицирован гликозид Г1,определенный как -глюкозилглицерин, с гликозиднойсвязью по гидроксилу при С2 глицерина и С1глюкозы. Молекулярная масса ТК составилаоколо 6,0 кДа, что, учитывая структуруполимера, составляет 19-20 повторяющихсязвеньев. Таким образом, предположительноТК была 1,3-поли(глицерофосфатом) полностьюзамещенным -глюкозой (такая конфигурациягликозидного центра глюкозы найденавпервые у актиномицетов) по гидроксилу приС2 глицерина, что было подтвержденометодами ЯМР-спектроскопии (Тульская и др.,1993).

G. harbinensis ВКМ Ас-1247Т, G. harbinensis NRRL 16897 и G.harbinensis IFO 14487T.Качественный состав компонентов клеточныхстенок всех трех штаммов был одинаков. Вкислотных гидролизатахклеточных стенок ивыделенных из них ТК были обнаруженыфосфорные эфиры глицерина и глюкоза. Впродуктах HF-гидролизе ТК всех трех штаммовобнаружено по два гликозида: Г1 – -глюкопиранозил-(12)-глицерин и Г2 – -глюкопиранозил-(11)-глицерин.Обнаружение двух гликозидовсвидетельствовало о присутствии вклеточных стенках двух ТК (ТК1 и ТК2),имеющих одинаковый поли(глицерофосфатный)кор и одинаковые заместители – -глюкопиранозу,которая присоединена к глицериновымостаткам по-разному. Фосфодиэфирную связьв полимерах локализовали с помощьюЯМР-спектроскопии. Таким образом, в трехштаммах G. harbinensis обнаружено по две ТК: ТК1 –1,3-поли(глицерофосфат), полностьюзамещенный по гидроксилу при С2 глицеринаостатками -глюкозы; а также ТК2 –2,3-поли(глицерофосфат) с остатками -глюкозы погидроксилу при С1 глицерина (Тульская и др.,1993; Потехина и др., 1998).

5.3. Структуры тейхоевыхкислот клеточных стенок видов рода Nocardioides

В этом разделепредставлены сведения о структурах ТК,обнаруженных нами у изученныхпредставителей рода Nocardioides (Prauser, 1976).

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 12 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»