WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 12 |

набор иструктура тейхоевых кислот игликополимеров клеточных стенокпредставителей порядка Actinomycetales являютсятаксономически значимой фенотипическойхарактеристикой таксонов разных уровней(от подпорядка до вида);

клеточные стенки фитопатогенныхстрептомицетов характеризуются ярковыраженными анионными свойствами, которыеобеспечены наличием в них комплекса кислыхполимеров гетерогенного состава:тейхоевыми и тейхуроновыми кислотами спировиноградной или глутаминовой кислотойв качестве дополнительного кислогокомпонента, кислыми поли/олигосахаридами;

выявление новых структур гликополимеровклеточной стенки может служить не толькомаркером новых видов или подвидовактиномицетов, но и указывать нанеизвестные до сего времени экологическиефункции изучаемых организмов.

Апробация работы. Материалы диссертации былипредставлены на Всесоюзной конференция«Регуляция микробного метаболизма»(Пущино, 1989); Международных симпозиумах побиологии актиномицетов (Madison, 1991; Москва,1994); Всероссийской конференции «Биосинтези деградация микробных полимеров.Фундаментальные и прикладные аспекты»(Пущино, 1995); Международной конференции«Микробное разнообразие» (Пермь, 1996);Втором съезде Биохимического обществаРоссийской АН, Москва, 1997); Международномсимпозиуме «Современные проблемы биохимиимикроорганизмов и биотехнологии» (Пущино,2000); Втором Германо-Польско-Российскомсъезде по углеводам бактерий (Москва, 2002);Первой Всероссийской конференции поиммунитету растений к болезням ивредителям (Санкт-Петербург, 2002); Первомконгрессе FEMS Европейских микробиологов(Ljubljana, 2003); II Московском международномконгрессе по биотехнологии (Москва, 2003); IIIВсероссийской школе-конференции «Химия ибиохимия углеводов» (Саратов, 2004);Всероссийском симпозиуме «Биотехнологиямикробов», (Москва, 2004); Всероссийскомсимпозиуме с международным участием«Автотрофные микроорганизмы» (Москва, 2005);Международном конгрессе коллекций культурмикроорганизмов (Gslar, 2007); IV съезде Российскогообщества биохимиков и молекулярныхбиологов (Новосибирск, 2008).

Публикации. По материалам диссертацииопубликовано 45 работ, из них обзор и 24экспериментальные статьи в рекомендуемыхВАК’омизданиях; тезисы 20 докладов.

Структура и объемработы. Диссертация изложенана 350 страницах машинописного текста исостоит из введения, 9-ти глав, включающихматериалы литературных источников,касающиеся темы данной работы (3 главыобзора литературы), краткой характеристикиобъектов и методов исследований (однаглава), изложения результатов собственныхисследований (4 главы), а также главы,посвященной обсуждению полученныхрезультатов. Кроме того, имеется общеезаключение и выводы. Работа содержит 64таблицы, 54 рисунка. Список цитируемойлитературы содержит 720 ссылок. В Приложенииприведён полный список исследованныхштаммов актиномицетов с указаниемобнаруженных моносахаридов, а такженаличия (отсутствия) тейхоевых кислот в ихклеточных стенках; таблицы баз данных поЯМР-спектрам найденных тейхоевых кислот идругих гликополимеров.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературы

Тейхоевые кислоты идругие гликополимеры клеточных стенокграмположительных бактерий: структурноеразнообразие, распространение и некоторыефункции, экологические аспекты.

Главы I, II, III. В литературном обзоре представленысведения, касающиеся строениябактериальной клеточной стенки;разнообразия структурных вариаций,распространения и некоторых функцийтейхоевых кислот и других гликополимеровклеточных стенок грамположительныхбактерий. Особое внимание уделеноназванным полимерам клеточных стенокпредставителей порядка Actinomycetales. Приведенысведения, касающиеся современнойклассификации актиномицетов. Отмеченаособая значимость хемотаксономическихпризнаков, отражающих химический состав истроение клетки и клеточной стенки иявляющихся одной из наиболее значимыхгрупп фенотипических признаков всистематике актиномицетов. Обоснованаактуальность и перспективность изучениятейхоевых кислот и других гликополимеровклеточной стенки с целью использования дляразвития системы классификацииактиномицетов. Представлены сведения офитопатогенных стрептомицетах, их видовомсоставе, а также данные об известных кнастоящему времени возможных факторахпатогенности, в числе которых некоторыебиополимеры клеточных стенок.

Экспериментальнаячасть

Глава IV. Материалы иметоды, использованные в работе. В работе использован рядмикробиологических, химических,биохимических, инструментальных методовисследования. Методики, как правило, былиописаны в литературе ранее имодифицированы для решения поставленных вработе задач. Исследовано более 100 штаммовактиномицетов, относящихся к различнымродам актиномицетов из 12-ти семейств 9-типодпорядков порядка Actinomycetales (http://www.bacterio.cict.fr) изразличных коллекций микроорганизмов, в томчисле ИНА, ВКМ и НИИ картофелеводстваБелНАН. Морфологические и культуральныепризнаки определяли как описано Гаузе и др.(1983). Биомассу, собранную налогарифмической фазе роста, использовалидля получения клеточных стенок(Стрешинская и др., 1979). Пептидогликанполучали по модифицированному методу (Elliottet al., 1975). Анализ сахаров в кислотныхгидролизатах клеточных стенок изучаемыхактиномицетов, а также изомеровдиаминопимелиновой кислоты впептидогликане после его кислотногогидролиза, осуществляли методомхроматографии на бумаге сравнением состандартными образцами (Стрешинская и др.,1989). Фосфолипиды определяли по методу,описанному ранее (Minnikin et al., 1984; O’Donnel et al., 1985).Тейхоевые кислоты (ТК) и гликополимерыэкстрагировали 10%-ной трихлоруксуснойкислотой (ТХУ) из клеточных стенок иобезжиренного мицелия. Очистку проводилина DEAE-Toyopearl 650M в линейном градиенте NaCl(0–0,5 М),методом препаративного высоковольтногоэлектрофореза, а также фракционировали спомощью дробного осаждения этанолом(Tul’skaya et al., 1991).

Таблица 1. Основныепродукты кислотного (2 М HCl, 100°, 3 ч) ищелочного (1 М NaOH, 100°, 3 ч) гидролизовизученных ТК.

Тейхоевая кислота

Основныепродукты гидролиза

Тип ТК

Структура ТК

Кислотныйгидролиз

Щелочнойгидролиз

I G, 1,3

1,3-поли(глицерофосфат)

GroP; GroP2; Gro; Pi; С/З*

GroP; GroP2; Gro2P3; Pi; ФЭ**

I G, 2,3

2,3-поли(глицерофосфат)

GroP; GroP2; Gro; Pi; С/З

GroP; GroP2; Pi; ФЭ*

I R, 1,5

1,5-поли(рибитфосфат)

RboP; AhRboP; RboP2; Rbo; AhRbo; Pi; С/З

RboP; RboP2; Pi;ФЭ*

I R, 3,5

3,5-поли(рибитфосфат)

RboP; RboP2; Rbo; AhRbo; Pi

RboP; RboP2; Rbo; AhRbo; Pi

II GS, 3,3

Поли(гликозилглицерофосфат)

GroP; Gro; Pi; С/З

Gro; ФЭ

IV GS

Поли(глицерофосфат-гликозилглицерофосфат)

GroP; GroP2; Gro; Pi; С/З

GroP; GroP2; Pi; ФЭ; Э3

Gro-глицерин; GroP-глицерофосфат;GroP2-бисфосфатглицерина; Gro2P3-диглицеринтрифосфат; Rbo-рибит;AhRbo-ангидрорибит; RboP-рибитфосфат;AhRboP-ангидрорибитфосфат; RboP2-бисфосфат рибита;Pi минеральныйфосфат; ФЭ –фосфорные эфиры; Э3 – см. раздел 5.1.;

* боковой заместитель наостатке полиола или сахарид в кореполимера;

** фосфорные эфиры образуютсяпри наличии заместителей на остаткахполиола.

Первичную структуру ТКи гликополимеров, а именно:качественный состав (видполиола, наличие и природа заместителей,моносахаридный состав), строениемономерных единиц, локализациюфосфодиэфирной связи, изучалихимическими методами. Последние основанына расщеплении молекулы полимера(кислотный, щелочной, ферментативныйгидролизы) и изучении качественного иколичественного состава полученныхфрагментов, подвижности последних вэлектрическом поле (высоковольтныйэлектрофорез) и в различныххроматографических системах относительностандартных образцов, способностиокрашиваться различными проявителями.Анализируя фосфорные эфиры полиолов, можнопредварительно говорить о типе ТК (табл. 1).Абсолютную конфигурацию некоторыхзаместителей определяли, как описано (Gerwig etal., 1979; Gorshkova et al., 1997; Shashkov et al., 2006). Данные остроении фрагментов анализировали, чтопозволяло реконструировать структуруполимера (Kelemen and Baddiley, 1961). Молекулярныемассы ТК определяли с помощьюгельфильтрации на сефадексе G-50 (Tul’skaya et al., 1991).Результаты химических исследованийподтверждали методами ЯМР-спектроскопии(Shashkov et al., 2001). Применялись также методы MALDITOF масс-спектроскопии для определенияструктуры и молекулярной массы олигомераKdn (Shashkov et al., 2002 а). Определение патогенностина картофеле и проростках редисаосуществляли по описанному методу (Goyer et al.,1998). Наличие такстомина в культуральнойжидкости исследуемого стрептомицетапроводили методом тонкослойнойхроматографии.

Для определениянуклеотидной последовательности гена 16SрРНК использовали универсальныебактериальные праймеры 27f (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG), 530f(5'-GTGCCAGCAGCCGCGC) и 1492r (5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT).Определение нуклеотиднойпоследовательности 16S рРНК проводили на автоматическомсеквенаторе CEQ2000 XL (Beckman Coulter, США) всоответствии с предлагаемым фирмойпротоколом. Для филогенетического анализаполученную нуклеотиднуюпоследовательность гена 16S рРНК изучаемогоорганизма выравнивали споследовательностями типовых иреферентных штаммов с помощью программыCLUSTAL W. Эволюционное расстояниерассчитывали по алгоритму (Ohta and Kimura, 1971; Kimuraand Ohta 1973). Для ДНК-ДНК гибридизации Н3-меченную ДНКполучали с использованием (1',2',5'-3H)дезоксицитидин-трифосфата и ферментов дляник-трансляци N 5500 (Amersham). ДНК-ДНКгибридизацию проводили на мембранныхфильтрах (“Hiiu Kalur”, Таллин, Эстония) воптимальных условиях (раствор Денхарда с 50%формамида (об/об), 50° С, 24 ч), как описано (Tijssen, 1993).

Результатыисследований

Глава V. Разнообразиеструктур тейхоевых кислот и другихгликополимеров клеточных стенокактиномицетов.

Материальнойосновой выявления разнообразия, различныхфункций в жизни микроорганизма ивозможности примененияТК и гликополимеровклеточных стенок в таксономииактиномицетов является знание структурэтих соединений. В настоящей главеприведены сведения, касающиесяустановления структур полимеров клеточныхстенок актиномицетов, изученных вработе.

5.1. Структуры тейхоевых кислотклеточных стенок видов и подвидов родаNocardiopsis

В данном разделеприведены структуры ТК клеточных стенок 29штаммов, принадлежащих 9 видам и подвидамактиномицетов рода Nocardiopsis, установленныенами.

N. dassonvillei ssp. dassonvillei и N. dassonvillei ssp. antarctica. Подробное изучениеструктуры ТК клеточных стенок с получениеми исследованием фосфорных эфиров игликозида различными химическимиметодами, определение соотношенийкомпонентов их составляющих, определениемолекулярной массы ТК, а такжеЯМР-спектроскопические исследованияпроводили на трех штаммах N.dassonvillei ssp.dassonvillei (ВКМ Ас-797Т, ВКМ Ас-773, IMRU 504), атакже N. dassonvillei ssp. antarcticus ВКМ Ас-836T. Позднее аналогичным образом былиисследованы ТК 15-ти изолятов из почвСейшельских островов.

Рис. 1. Повторяющеесязвено и схема щелочного гидролиза ТКклеточных стенок N. dassonvillei ssp. dassonvillei и N. dassonvillei ssp. аntarcticа. Возможные пути щелочного гидролизаобозначены a иб

Кислотный гидролиз ТКпривел к образованию моно- и бисфосфатовглицерина, галактозамина, глицерина,неорганического фосфора и фосфорногоэфира 1 (Э1).Последний был идентифицирован какмонофосфорный эфир галактозамина.Основным продуктом HF-деградации полимерабыл гликозид 1 (Г1), который оказался -GalpNAc-(12)-snGro.Наибольшая информация о структуреисследуемого полимера была получена приисследовании продуктов его щелочногогидролиза (рис. 1). При этом образовался рядэфиров, основными среди которых были: Э2, идентифицированныйкак -GalpNAc-(12)-snGro-(3-P; быстро движущийся каноду эфир Э3,который содержал два остатка глицерина,один N-ацетилгалактозаминильный остатоки три фосфатных группы [P-3/4)-GalpNAc-(12)- snGro-(3-P-1)-snGro-(2-P], а также моно- ибисфосфат глицерина (Э4). В работе рассмотрены путищелочного гидролиза, имеющие место принебычной структуре полимера, чтоподтверждает вновь обнаруженную структуру(рис.1).

Независимо былопроведено ЯМР спектроскопическое изучениепрепаратов ТК изучаемых организмов. Всоставе повторяющегося звена полимеранайдены 2-ацетамидо-2-дезокси--D-галактопираноза сфосфатным остатком по гидроксилу при С3 инезамещенный остаток глицерина снеэквивалентными фосфатными группами иидентифицированы все сигналы этихостатков в спектре 13С-ЯМР (рис. 1). Оставшиеся три сигнала,несомненно, принадлежали еще одномуостатку глицерина, алкилированному погидроксилу при С2 и фосфорилированному погидроксилу при С3. Об этом свидетельствовалслабопольный сдвиг сигнала при 80,20 м.д.(СН-группа согласно АРТ-спектру) и егорасщепление в дублет, а также уширение пикапри 65,55 м.д. и отсутствие расщепления илиуширения пика при 62,15 м.д. (СН2-группы). В результатевсех экспериментов была реконструированаструктура ТК (рис. 1, 6 а). Все 19 изученных штаммов,принадлежащих виду N. dassonvilleissp.dassonvillei (впоследствии N. antarcticus был переведенв N. dassonvillei ssp. аntarcticа) содержали в клеточной стенке около20% ТК идентичной уникальной структуры,относящейся к новому IV типу (смешаннаяструктура, Naumova et al., 2001). Молекулярная массаполимера около 6,4 кДа, что соответствует 11-13повторяющимся поли(глицерофосфат--N-ацетилгалактозаминилглицерофосфатным)звеньям. ТК такой структуры дает необычныепродукты щелочного гидролиза (рис. 1),включая так называемый фосфодиэфир Э3 (Тульская и др., 1992;Tul’skaya et al.,1993).

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 12 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»