WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

С целью идентификации хромосомного состава аллоплазматических линий был использован SSR-анализ, основанный на применении микросателлитных маркеров, локализованных на определенных хромосомах мягкой пшеницы. По наличию или отсутствию фрагментов амплификации соответствующей длины, характерных для определенных маркеров, можно сделать вывод о присутствии в геноме изучаемых аллоплазматических линий тех хромосом мягкой пшеницы (или ее фрагментов), на которых картированы данные маркеры. Задача данного раздела работы – с помощью анализа микросателлитов выявить, какие хромосомы мягкой пшеницы замещены хромосомами дикорастущего ячменя.

В эту часть работы были включены линии Л-29, Л-49, Л-26, Л-27, Л-38 и потомство растений группы 218, которые были изучены с помощью геномной гибридизации in situ (табл. 3), а также линия Л-32 и потомство растений 218(7), 218(9), 218(14), которые не были изучены с применением GISH-анализа.

Для анализа были использованы 89 микросателлитных маркеров пшеницы (Xgwm). Количество маркеров на хромосому варьировало от 3 до 8, при этом использовались маркеры, локализованные как на коротком, так и на длинном плечах каждой хромосомы мягкой пшеницы. Изучение характера амплификации SSR-маркеров в геномах мягкой пшеницы и ячменя (H.mar) позволило выявить достаточно высокий уровень полиморфизма микросателлитных локусов как между сортами пшеницы Пиротрикс 28 и Новосибирская 67, так и между этими сортами пшеницы и дикорастущим ячменем H.marinum subsp. gussoneanum. Данное обстоятельство позволяет использовать SSR-маркеры мягкой пшеницы для анализа геномов у аллоплазматических линий – потомков ячменно-пшеничных гибридов.

Изучение аллоплазматических эуплоидных линий Л-29 и Л-49, в создании которых в качестве отцовского родителя использован только сорт мягкой пшеницы Пиротрикс 28, привело к выявлению в их геномах присутствия фрагментов амплификации, характерных для этого сорта пшеницы. Анализ распределения микросателлитных маркеров в геномах аллоплазматических анеплоидных линий Л-26 и Л-27 показал, что практически все хромосомы содержат одновременно маркеры обоих сортов мягкой пшеницы – Пиротрикс 28 и Новосибирская 67, использованных при создании этих линий. В геномах растений 218(3), 218(7), 218(9), 218(11), 218(12) и 218(14) большинство SSR-маркеров амплифицировали фрагменты, специфичные для сорта Новосибирская 67, используемого в трех из четырех возвратных скрещиваний с ячменно-пшеничными гибридами, и только хромосомы 5В и 7В содержали маркеры сорта мягкой пшеницы Пиротрикс 28. Таким образом, у аллоплазматических линий формируется ядерный геном, рекомбинантный по различным сортам пшеницы, введенным в беккроссирование.

В результате SSR-анализа в геномах аллоплазматических эуплоидных (2n=42) линий Л-29, Л-49, потомков растений 218(3), 218(7), 218(9), 218(11), 218(12), 218(14) и анеуплоидной линии Л-32 была обнаружена амплификация SSR-маркеров пшеницы (Xgwm) всех хромосом, за исключением маркеров, локализованных на 7D хромосоме. На основании этого можно сделать вывод о присутствии в кариотипах данных линий всех хромосом пшеницы, кроме хромосомы 7D. Отсутствующая пара хромосом 7D, по всей видимости, в кариотипе эуплоидов замещена на гомеологичную пару хромосом седьмой группы ячменя H.marinum subsp. gussoneanum (7Нmar). У анеуплоидной линии Л-32 с числом хромосом 2n = 40 + 2t отсутствующая пара хромосом 7D, по всей видимости, замещена парой телоцентриков, образовавшихся от хромосомы дикорастущего ячменя 7Нmar.

У аллоплазматических анеуплоидных линий Л-26 и Л-27 (2n = 42 + 4t) не выявлено продуктов амплификации маркеров короткого плеча хромосомы 7D, но наблюдалась амплификация маркеров длинного плеча хромосомы 7D. Это указывает на пшеничное происхождение некоторых из четырех телоцентрических хромосом у этих линий. Ранее проведенное исследование этих линий с помощью GISH-анализа свидетельствует о присутствии в их геномах двух телоцентрических хромосом пшеницы и двух телоцентрических хромосом ячменя (H.mar). Следовательно, пара телоцентрических хромосом пшеницы у линий Л-26 и Л-27 соответствует длинному плечу хромосомы 7D.

Принадлежность выявленных у линий Л-29, Л-26 и Л-27 хромосом ячменя или их сегментов седьмой гомеологичной группе ячменя была подтверждена методом С-окрашивания, проведенным Е.Д. Бадаевой (Трубачеева, Бадаева и др., 2007).

На основании полученных данных о геномном составе самофертильных аллоплазматических линий мягкой пшеницы, несущих цитоплазму дикорастущего ячменя H.marinum subsp. gussoneanum, можно заключить, что ядерный геном мягкой пшеницы и цитоплазма этого вида ячменя совместимы, а хромосомы ячменя способны компенсировать отсутствующие гомеологичные хромосомы пшеницы.

Изучение митохондриальных геномов аллоплазматических (H.marinum subsp. gussoneanum)-T.aestivum

RFLP-анализ локусов митохондриальной ДНК

Для определения типа родительских митохондриальных последовательностей у аллоплазматических линий был использован RFLP-анализ, в качестве зондов для которого выступали клонированные последовательности участков трех локусов мтДНК пшеницы – nad3-orf156, atpA-atp9, atp6-rps13 (Wang et al., 2000; Tsukamoto et al., 2000). Соответствие клонированных вставок исходным последовательностям митохондриального генома было проверено секвенированием. Саузерн-блот гибридизация была проведена путем обработки тотальной ДНК тремя эндонуклеазами рестрикции с последующей гибридизацией каждого отдельного рестрикционного спектра с тремя митохондриальными зондами. Сравнение спектров блот-гибридизации выявило высокий уровень полиморфизма между дикорастущим ячменем и мягкой пшеницей, что позволяет считать данный метод подходящим для определения типов митохондриальных геномов у беккроссных потомков ячменно-пшеничных гибридов.

По результатам проведенного RFLP-анализа, изученные аллоплазматические линии можно разделить на две группы. Одну из них образуют линии Л-29, Л-26 и Л-27. Во всех проанализированных комбинациях эндонуклеаза рестрикции/зонд в гибридизационных спектрах этих линий присутствовали фрагменты митохондриального генома ячменя (H.mar), использованного в качестве материнского генотипа при создании ячменно-пшеничных гибридов F1. Вместе с тем у этих трех линий при использовании зонда nad3-orf156 во всех случаях были выявлены фрагменты блот-гибридизации обоих родительских видов – и дикорастущего ячменя, и мягкой пшеницы одновременно. Такая же картина наблюдалась при использования зонда atp6-rps13 в сочетании с рестриктазой HindIII (рис. 4).

Вторую группу составляют линии Л-31 и Л-36. Во всех случаях у них было обнаружено присутствие митохондриальных фрагментов блот-гибридизации только сортов мягкой пшеницы, соответственно Пиротрикс 28 и Новосибирская 67, участвующих в создании этих линий.

Таким образом, RFLP-анализ оказался подходящим для изучения типов митохондриальных локусов у аллоплазматических линий мягкой пшеницы. В дальнейшем исследование было расширено за счет введения дополнительного растительного материала и применения метода ПЦР-анализа 18S/5S рекомбинационного повтора мтДНК.

ПЦР - анализ 18S/5S рекомбинационного повтора мтДНК

С целью определения родительского типа митохондриальных последовательностей у аллоплазматических линий мягкой пшеницы использована пара специфических ПЦР-праймеров к участку, фланкирующему 5' конец 18S/5S рекомбинационного повтора мтДНК злаков, для которого, как показано в литературе, характерна высокая вариабельность в семействе Graminaceae (Coulthart et al., 1993). Предварительный сравнительный ПЦР-анализ ячменя (H.mar) и мягкой пшеницы показал, что длины полученных фрагментов амплификации у этих видов отличаются на 50 п.н (рис. 5). Таким образом, различия, выявляемые у родительских видов при ПЦР участка 18S/5S локуса, дали возможность проанализировать присутствие того или иного типа данной последовательности у аллоплазматических линий (H.marinum subsp. gussoneanum)-T.aestivum.

Рис. 5. ПЦР - спектр, полученный при амплификации 5’ конца

18S/5S рекомбинационного повтора митохондриальной ДНК.

Обозначения: 1 - ячмень H.marinum subsp. gussoneanum, 2 - пшеница

T.aestivum Пиротрикс 28, 3 - пшеница T.aestivum Новосибирская 67,

4 – Л-29, 5 – Л-31, 7 - линия 26, 8 – Л-27, 9 – Л-36, 10 – 218(1), 11 – 218(2),

12 – 218(3), 13 – 218(7), 14 – 218(9), 15 – 218(11), 16 – 218(12), 17 – 218(14).

При амплификации района 18S/5S мтДНК было обнаружено, что ПЦР-спектры линий Л-29, Л-49, Л-26, Л-27, Л-35, Л-38 и Л-503 содержат одновременно фрагменты как ячменя (H.mar), так и сортов мягкой пшеницы, включенных в создание ячменно-пшеничных гибридов в качестве материнского и отцовского родителей, соответственно. В спектрах линий Л-31 и Л-36 наблюдались только фрагменты амплификации пшеницы, а у линии Л-32 – только ячменя. Среди потомков растений группы 218 были обнаружены разные типы митохондриальных последовательностей: гетероплазмия, то есть присутствие фрагментов амплификации митохондриальных геномов ячменя и пшеницы у потомков растений 218(3), 218(7), 218(9), 218(12), 218(14); фрагмент амплификации генома пшеницы у потомков растений 218(1) и 218(2); фрагмент амплификации генома ячменя у потомков растения 218(11).

При сравнении результатов ПЦР-анализа локуса 18S/5S мтДНК с данными, полученными при RFLP-анализе трех других локусов пяти линий (Л-29, Л-31, Л-26, Л-27, Л-36) обнаружены следующие закономерности. Во всех изученных случаях у линий Л-31 и Л-36 наблюдались митохондриальные последовательности только отцовского, то есть пшеничного типа; у линий Л-29, Л-26 и Л-27 при RFLP-анализе были обнаружены либо материнские ячменные последовательности, либо гетероплазмия, при ПЦР-анализе 18S/5S локуса – только гетероплазмия. Необходимо отметить, что растения линии Л-32 и потомки растения 218(11), у которых при анализе 18S/5S локуса были обнаружены митохондриальные последовательности только материнского ячменного типа, в в последующих самоопыленных поколениях проявили практически полную стерильность.

Сопоставление результатов изучения ядерных и митохондриальных геномов аллпоплазматических линий позволило выявить взаимосвязь между между присутствием последовательностей мтДНК определенного родительского типа, наличием хромосом ячменя в ядерном геноме аллоплазматических линий и проявлением фертильности растений.

ВЫВОДЫ

1. Впервые с применением RAPD-анализа охарактеризованы ядерные геномы аллоплазматических эуплоидных и анеуплоидных линий (H. marinum subsp. gussoneanum)-T. aestivum разного происхождения и показано, что формирование этих линий сопровождается встраиванием в геном мягкой пшеницы фрагментов генома дикорастущего ячменя.

2. На основании результатов геномной in situ гибридизации установлено, что аллоплазматические эуплоидные линии (H. marinum subsp. gussoneanum)-T. aestivum представлены тремя вариантами: с замещением трех пар хромосом мягкой пшеницы на три пары хромосом ячменя (2n = 36w + 6b), с замещением пары хромосом мягкой пшеницы на пару хромосом ячменя (2n = 40w + 2b), не содержащие хромосом дикорастущего ячменя (2n = 42w) (w – wheat, b – barley). Показано, что у анеуплоидных линий (H.marinum subsp. gussoneanum)-T. aestivum присутствуют телоцентрические хромосомы ячменя (2n=40w+2tb), (2n=42w+2tb) или телоцентрические хромосомы как ячменя, так и пшеницы (2n=40w+2tw+2tb).

3. Результаты SSR-анализа указывают на предпочтительное замещение хромосомы 7D на гомеологичные хромосомы ячменя H.marinum subsp. gussoneanum у самофертильных аллоплазматических эуплоидных линий (2n=40w+2b). У аллоплазматических анеуплоидных линий (2n=40w+2tw+2tb) две телоцентрические хромосомы соответствуют длинному плечу хромосомы мягкой пшеницы 7D.

4. Установлено, что определенный тип последовательностей мтДНК у аллоплазматических эуплоидных и анеуплоидных линий (H.marinum subsp. gussoneanum)-T. aestivum ассоциирует с проявлением фертильности растений и наличием хромосом ячменя в ядерном геноме:

• стабильно самофертильные аллоплазматические эуплоидные линии, не имеющие хромосом ячменя, по всем изученным локусам мтДНК содержали последовательности отцовского типа;

• у аллоплазматических замещенных и анеуплоидных линий мягкой пшеницы с пониженной фертильностью выявлена гетероплазмия (одновременное присутствие последовательностей и ячменного, и пшеничного типов) по митохондриальному локусу 18S/5S;

• стерильные и нежизнеспособные образцы аллоплазматических замещенных линий содержали последовательности ячменного типа митохондриального локуса 18S/5S.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Bildanova L.L., Troubacheeva N.V., Salina E.A., Pershina L.A. 2001. Molecular changes in the genome of backcrossed progenies of barley-wheat hybrids. EWAC Newsl. N 11: 92-94.

2. Бильданова Л.Л., Трубачеева Н.В., Песцова Е.Г., Щербань А.Б. 2001. Молекулярный анализ ретротранспозон-зависимых изменений в геномах ячменно-пшеничных гибридов. Конкурс молодых ученых СО РАН 1997-1998 гг. Биологические науки. Сборник трудов. Институт цитологии и генетики СО РАН, С.7-10.

3. Pershina L.A., Numerova O.M., Belova L.I., Devyatkina E.P., Bildanova L.L., Troubacheeva N.V., Salina E.A. 2001. Alloplasmic lines of wheat T.aestivum L. with cytoplasm of barley H.vulgare L. In: Genetic Collection, Isogenic and Alloplasmic Lines. Proc. Intern. Conf. July 30-August 3, 2001.- Novosibirsk. p. 98-100.

4. Трубачеева Н.В., Бильданова Л.Л. 2001. Характеристика генома аллоплазматических линий пшеницы с использованием RAPD - метода. Тезисы международной конференции молодых ученых «Современные проблемы генетики, биотехнологии и селекции растений», 2-7 июля 2001 г., Институт растениеводства им. В.Я.Юрьева Украинской Академии аграрных наук, Харьков. с.18-19.

5. Pershina L.A., Numerova O.M., Salina E.A., Bildanova L.L., Troubacheeva N.V., Shumny V.K. 2001. The study of barley-rye, barley-wheat hybrids and production different genotypes of alloplasmic lines of wheat using barley-wheat hybrids. Book of abstracts of 4th International Triticeae Symposium, Cordoba, Spain. p.122.

6. Трубачеева Н.В., Салина Е.А., Нумерова О.М., Першина Л.А. 2003. Изучение характера интрогрессии генетического материала ячменя в геноме аллоплазматических линий пшеницы H.geniculatum All./ T.aestivum L. с помощью RAPD-анализа. Генетика. Т.39. №6. c.791-795.

Pages:     | 1 | 2 || 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»