WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 12 |

На правах рукописи

СУЛТАНОВ

Заман Зубаирович

РАЗРАБОТКА ИУСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИЙ ПОЛУЧЕНИЯМИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ

ПИТАТЕЛЬНЫХ ОСНОВ ИСРЕД

03.00.07 -микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соисканиеученой степени

доктора биологическихнаук

Махачкала – 2008

Работа выполнена в ФГУП«НПО «Микроген» МЗ и СР РФ НПО «Питательныесреды»

Научный консультант:доктор медицинских наук,профессор

Меджидов Магомед Меджидович

Официальные оппоненты:доктор биологических наук,профессор

Лариса Петровна Блинкова

доктор медицинских наук, профессор

Виктор Михайлович Бондаренко

доктор медицинских наук, профессор

Станислав Степанович Афанасьев

Ведущая организация:ФГУН ГосНИИ стандартизации иконтроля медицинских и биологическихпрепаратов им. Л.А.ТарасевичаРоспотребнадзора

Защита диссертациисостоится «25» сентября в 1200 часов на заседаниидиссертационного совета Д 001.035.01 при ГУ НИИвакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН поадресу: 105064, Москва, Малый Казенныйпереулок, д.5а.

С диссертацией можноознакомиться в библиотеке ГУ НИИ вакцини сывороток им. И.И.Мечникова РАМН

Автореферат разослан«____»__________________

Ученый секретарь

диссертационногосовета

кандидат биологическихнаукИ.В.Яковлева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКАРАБОТЫ

Актуальностьпроблемы. Задачи, стоящиеперед отечественным здравоохранением поснижению уровня инфекционных болезней,тесно связаны с их бактериологическойдиагностикой, которая в значительнойстепени зависит от качества и ассортиментапитательных сред.

Однако научные ипрактические учреждения нашей страны всееще недостаточно обеспечены стандартнымипитательными средами и поэтому вынужденыиспользовать среды лабораторногоприготовления, которые получают сприменением низкокачественныхкомпонентов и не всегда проверяют сэталонными тест-штаммами, т.е. ихприменение происходит без необходимогоконтроля. Нестандартность питательныхсред, приготовляемых в условияхлабораторий, отрицательно влияет нарезультаты диагностики инфекций. Зарубежом используют только коммерческиепитательные среды, имеющиесоответствующие сертификаты качества(А.Г.Бойцов, О.Н.Ластова, А.А.Порин, 2000; NationalCommittee for Clinical Laboratory Standards, 1990).

Одним из факторов,определяющих качество питательных сред,является наличие в их составе стандартныхбелковых основ. Питательными субстратамибольшинства сред служат белковыегидролизаты различного происхождения. Приэтом в качестве белкового сырья используютчаще всего мясо, рыбу, рыбную муку иказеин.

Основным белковымсырьем в промышленном производствепитательных сред в НПО «Питательные среды»является каспийская килька (М.М.Меджидов,2003). Однако из-за экологических проблемКаспия ее улов значительно снизился и сталощущаться дефицит этого сырья. Поэтомунеобходимы резервные источники сырья,позволяющие осуществить замену кильки надругие источники сырья без измененияконечных характеристик получаемыхпрепаратов и условий на всех стадияхтехнологического процесса.

Одним из наиболееиспользуемых компонентов питательных средявляется ферментативный пептон.Промышленный выпуск сухого пептона в РФбыл прекращен и в незначительных объемахначинает возрождаться. Пептоныпроизводства Семипалатинского иВинницкого мясокомбинатов не отличаютсястабильностью, что вызывает необходимостьзакупки дорогостоящих пептонов фирм,использующих в качестве сырья мясо высшейкатегории (В.И.Артюхин, А.П.Шепелин,Н.В.Киселева, 1990). В этой связи разработкатехнологии получения отечественногопептона, не уступающего по качествузарубежным аналогам с использованиемболее дешевого сырья, является актуальнойзадачей.

За рубежом в составекоммерческих питательных сред длякультивирования и выделениямикроорганизмов широко используютсягидролизаты сои (Culture Media Manual, bioMerieux, 1994;Microbiology Manual «Merck», 1990). В нашей стране донедавнего времени среды на основе сои невыпускались, что, прежде всего, связано сотсутствием разработок отечественныхтехнологий получения соевыхгидролизатов.

В приготовлениипитательных сред в качестве стимуляторароста микроорганизмов широко используютэкстракт кормовых дрожжей (ЭКД)(А.К.Баранова, 1978; Б.М.Раскин, 1982). Однакосуществующие технологии его получения необеспечивают прозрачность растворов(Н.А.Ковчик, И.И.Литвиненко, 1980). Данныйпоказатель является важным, особенно прииспользовании ЭКД в составе жидких сред,т.к. о наличии роста микроорганизмов судятпо помутнению среды. Кроме того, водныерастворы ЭКД, представляющие собойполидисперсную коллоидную систему, быстрозабивают поры фильтрующего материала искорость фильтрации резко падает. Отсюдавытекает необходимость совершенствованиятехнологии получения ЭКД на этапефильтрации и повышения степенипрозрачности растворов препарата.

Известно, что выделениечистых культур микроорганизмовзначительно осложняется, если в микробнойассоциации присутствует протей, способныйк роению. Для подавления роения протеевобычно используют различные химическиевещества. Однако данные вещества,препятствуя роению протеев, могутингибировать и рост выделяемыхмикроорганизмов. Вместе с тем, роениепротеев может быть устранено на средах,содержащих питательную основу сминимальным содержанием минеральныхвеществ –электролит-дефицитную (G.H.Sandus, 1960). В РФпитательные среды наэлектролит-дефицитной основе невыпускались, что было связано сотсутствием технологии ееполучения.

В мировой практике прибактериологическом анализе мочи, помимонеселективной среды – электролит-дефицитной, используюттакже селективную среду и среду дляопределения антибактериальных субстанцийв моче (Culture Media bioMerieux, 1994). Данный комплекспитательных сред позволяет осуществитьбыструю идентификацию возбудителейуроинфекций и оценить эффективностьантимикробной терапии. Аналогичныепитательные среды в РФ отсутствуют.

В последние годы в рядестран отмечают вспышки эшерихиоза,вызванного высокопатогенными для человекаE. coli O157:H7,продуцирующими шигаподобный токсин(Ю.А.Ратинер, В.М.Бондаренко, A.Siitonen, 1998; GriffinP.M., Ciclak P.R., 1994). В связи с высокойпатогенностью и глобальнымраспространением данной инфекции задачасовершенствования способов индикацииE. coli O157:H7весьма актуальна. При этом особое вниманиеследует уделить исследованиям,направленным на разработку селективныхсред, способствующих получению чистойкультуры.

Ввиду неуклонного ростачисленности больных и высокой летальностипри инфекционных заболеваниях бактериемияи сепсис являются одной из актуальныхпроблем современной медицины(В.Б.Белобородов, 1998; В.А.Руднов, 2000;В.С.Савельев, Б.Р.Гельфанд, 2006).

В диагностикебактериемии и сепсиса особое значениеимеют микробиологические исследованиякрови, которые являются обязательнымкомпонентом даже при подозрении на сепсис.Вместе с тем, ряд исследователей отмечаютнизкий процент высеваемости гемокультурпри использовании сред лабораторногоприготовления (В.Д.Бадиков, Л.Е.Журавлева,В.Н.Болехан, 1998; П.В.Кулагин, Р.П.Савченко,В.С.Иванова, 2001). В связи с этим, разработкакоммерческих готовых к употреблению среддля выделения гемокультуры являетсяактуальной задачей.

В последние десятилетияособое внимание клиницистов обращено нароль условно патогенных микроорганизмов вполиорганной патологии человека,требующих значительного увеличенияассортимента селективных питательных сред(В.М.Бондаренко, 2007). Возросли случаипищевых отравлений, вызываемых Bacillus cereus (Д.Диксон, 1983;Ф.С.Флуер, 2007; Kramer J.M., Gilbert R.J., 1989). Привыделении B. cereus из клинического материала иконтаминированных пищевых продуктоввозникают трудности, связанные с наличиемв образцах разнообразныхмикробов-ассоциантов (Р.С.Джалилова, 1987).Поэтому для выделения B.cereus из материалов,содержащих смешанную микрофлору,требуются высокоселективные среды.

Приведенные данныесвидетельствуют о необходимости изысканияновых источников сырья, разработок новыхпитательных основ и сред, и в первуюочередь, таких, как ферментативный пептон,электролит-дефицитная питательная основа,соевый гидролизат, среды для выделениявозбудителей при токсико-септическомсостоянии, уроинфекции, селекции различныхвидов энтеробактерий и бацилл.

Цель работы. Экспериментальное обоснованиеразработки и усовершенствованиятехнологий получения микробиологическихпитательных основ и сред.

Задачиисследования:

1. В результатеисследований выявить альтернативныеисточники белкового сырья дляпроизводства питательных сред.

2. Экспериментальнообосновать и разработать промышленнуютехнологию получения ферментативногопептона из рыбного сырья, изучитьфизико-химические и биологическиесвойства препарата.

3. Создать промышленнуютехнологию полученияэлектролит-дефицитной питательной основы,с использованием которой сконструироватьпитательные среды: для выделения,дифференциации и количественногоопределения бактерий в моче; для выделенияидифференциацииE. coli O157:H7; длявыделения и дифференциацииэнтеробактерий, а также изучить изфизико-химические и биологическиесвойства.

4. Разработатьтехнологию получения ферментативногогидролизата сои, изучить физико-химическиеи биологические свойства препарата.

5. Изыскать новыетехнологические решения полученияжелточной эмульсии, готовой купотреблению, с длительным сроком храненияи экстракта кормовых дрожжей с высокойстепенью прозрачности.

6. Экспериментальнообосновать состав и разработать сухуюселективную среду для бактериологическогоанализа мочи, а также питательную среду дляопределения антибактериальных субстанцийв моче. Изучить физико-химические ибиологические показатели созданных сред.

7. Разработать комплекспитательных сред для накопления, выделенияи субкультивирования гемокультур, изучитьфизико-химические и биологическиехарактеристики сконструированных сред.

8. Разработать новуюселективную питательную среду длявыделения B.cereus, изучитьфизико-химические и биологическиесвойства препарата.

Научная новизна. В экспериментальных исследованияхвыявлены альтернативные источникибелкового сырья для получения питательныхсред, позволяющие полноценно заменитькаспийскую кильку на другие источникибелкового сырья без изменения конечныххарактеристик получаемых основ и стадийтехнологического процесса.

Впервыеэкспериментально обоснована и разработанатехнология получения сухогоферментативного пептона из рыбного сырья,который по физико-химическим ибиологическим показателям не уступаетаналогичным препаратам ведущих зарубежныхфирм, но превосходит пептон производстваСемипалатинского мясокомбината и фирмыHiMedia.

Разработана технологияполучения электролит-дефицитнойпитательной основы из рыбного сырья.Показана способность данной основыподавлять роение протеев и одновременноспособствовать росту других патогенных иусловно патогенных микроорганизмов.

Разработана технологияполучения сухой питательной основы изотходов производства мяса криля.Питательный агар, приготовленный на даннойоснове, полностью соответствовалтребованиям Фармакопейной статьипредприятия на питательный агар - ФСП №42-0504-5807-04.

Изучены закономерностии определены оптимальные технологическиепараметры процессов получения гидролизатасои. Среды на основе этого гидролизатаобладали высокой чувствительностью,способны выявить рост микроорганизмов приминимальной посевной дозе, что указываетна его высокие ростовые свойства.

Усовершенствованатехнология получения ЭКД, обладающегоростстимулирующей активностью в отношениитест-штаммов ауксотрофных по витаминамгруппы В, а также полной прозрачностью ивысокой фильтруемостью.

Разработана технологияполучения желточной эмульсии дляопределения лецитиназной активностимикроорганизмов в готовом к употреблениювиде с длительным сроком хранения.

Научно обосновано новоенаправление в разработке отечественныхсред на электролит-дефицитной питательнойоснове. На этом субстрате разработаныновые питательные среды:электролит-дефицитный питательный агардля выделения, дифференциации иколичественного определения бактерий вмоче, питательная среда для выделения идифференциации E. coliO157:H7 и электролит-дефицитныйагар с эозин-метиленовым синим длявыделения и дифференциацииэнтеробактерий. Экспериментально показаныпреимущества электролит-дефицитных сред,которые заключались в способностиподавлять роение протеев и одновременноподдерживать рост выделяемыхмикроорганизмов.

Разработана сухаяселективная среда для выделения ипредварительной идентификациимикроорганизмов в моче. В экспериментахустановлено, что созданная среда совместнос неселективной средой при посеве мочипозволяет ускорить идентификациюмикроорганизмов.

Разработана новаяпитательная среда для определенияантибактериаль-ных субстанций в моче,обладающая высокой чувствительностью испособностью выявлять в моче низкиеконцентрации антибактериальныхпрепаратов.

Разработан комплекспитательных сред для накопления, выделенияи субкультивирования гемокультур.Показано преимущество разработанных средпо чувствительности и эффективностинакопления основных возбудителейгемоинфекций, что способствует выделениюгемокультуры при низкой напряженностибактериемии.

Разработанаселективная среда для выделения B. cereus в чистойкультуре из клинического материала ипищевых продуктов.

Основные положениянаучной новизны исследований подтверждены15 патентами и авторскимисвидетельствами.

Практическая значимостьработы и внедрение результатов впрактику. Предложеныальтернативные источники рыбного сырья,позволяющие расширить сырьевую базу дляпроизводства питательных сред.

В промышленноепроизводство внедрены новые технологииполучения белковых основ и питательныхсред, повышающие эффективностьпроизводства и расширяющие номенклатурупитательных сред.

Новые питательныесреды, позволяют улучшитьбактериологическую диагностикуинфекционных заболеваний.

По результатамвыполненных исследований утверждены НД:

ФСП 42-0504-3426-04, ПР№58944705-03-06. Питательная среда для выделенияи дифференциации E.coliO157:H7 и других энтеробактерийпо признаку ферментации сорбита, сухая(ЭДКС-агар);

ФСП 42-0504-3162-04, ПР№58944705-02-06. Питательная среда для выделения,дифференциации и количественногоопределения бактерий в мочеэлектролит-дефицитная сухая (ЭДПА);

ФСП 42-504-3427-04, ПР№58944705-01-06. Питательная среда для выделенияи дифференциации энтеробактерийселективная, сухая (типа Макконкиагара);

Промышленный регламентна производство питательного бульона длякультивирования микроорганизмов (СПБ)№1681-05;

Регламент производства№148-88 –Питательный агар для культивированиямикроорганизмов, сухой;

Регламент производства№1937-00, ФСП 42-3441-97, изменение 1. Экстракткормовых дрожжей для микробиологическихпитательных сред, сухой.

Основные положения,выносимые на защиту.

Pages:     || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 12 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»