WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |

Животные. Вработе были использованы крысы линий Sprague-Dawley, спонтанно гипертензивные крысы (SHR), крысы Fisher 344, мышиC57BL/6 и кролики NewZealand White. При проведениихирургических процедуру крыс и мышей применялинембуталовый наркоз (50мг/кг) В острыхэкспериментах у кроликов применяли нембутал (35 мг/кг) споследующимпереходом насмесь 1% -хлоралозы и 10%уретана (1.6мл/час).Вэхокардиографических обследованиях крыс использоваликетамин (22мг/кг в/м) иксилазин (2.7 мг/кг в/м).

Интермиттирующаягипоксия. Животных подвергали действию ИГ в камерах (Oxycycler A44XO; Biospherix, Redfield, NY, USA), снабженных системой компьютеризированного контроляподачи N2 ивоздуха дляподдержания в них уровня О2 всоответствиис заданным профилем (FIO28 %, 90 сек, сменяющиеся FIO2 = 21%., 90 сек, 12 часовв день с 7 до 19 часов). Остальное время FIO2 = 21%. Профильоксгенации/деоксигенации имитировалусловия обструктивного апноэ во сне у животных (экспериментальная модель ОАС,Fletcher et al, 1992). Уровень СО2 соответствовал 0.03%,температура в камере - 22-24С.Продолжительность хроническойинтермиттирующей гипоксии составляла 30-35 дней, острой-18 мин.

Электрофизиологическиеисследования. Электрическую активностьсимпатического, диафрагмального нервов иэлектромиограмму мышц животарегистрировали с помощью биполярныхплатиновых и игольчатых металлических (миограмма) электродов, соединенных с высокоимпедансным устройством входа (Grass Instruments).Сигналы былиусилены (дифференциальный усилитель,модель 511, Grass Instruments, пропущены через фильтр(30-3000 Гц) ипроинтегрированы (1/RC=50 мс; Grass P10Fкумулятивный интегратор), записаны с помощью полиграфа (Grass,модель 7; Astro-Med, Dash IV) Аналоговые сигналыоцифровывали (BuxcoElectronics) для последущегоанализа.

Измерения артериального давления и ЧСС. 1) В острых экспериментах у крыс приисследованиибарорефлексов и у кроликовАД регистрировали вбедренной артерии.Использовали преобразовательдавления иусилители(Grass, модель 7;модель P23db; Statham Laboratories, Hato Rey, Puerto Rico или BuxcoElectronics, Troy, NY) и полиграф Astro-Med, Dash IV.ЧСС измерялитахографом (модель 7Р4Н, Grass Instrument, Quincy, MA).2) Для регистрации АД, ЧССи ЭКГ усвободно перемещающихся крыс вбодрствующем состоянии и во время сна применялителеметрию (DataSciences Int. Inc., St. Paul, MN, USA).3)Неинвазивныеизмерения АД и ЧСС в серии онтогенетических исследований убодрствующих крыс производили вхвостовой артерии спомощью окклюзионной иплетизмографической манжеток и компьютеризированной системы обработкисигнала (CODA2;Kent Scientific Corp., Torrington, CT, USA).

Исследование барорефлекторной функции.Барорефлекторная чувствительность – интегральныйпоказатель статуса автономной системы контроляАД. Чувствительность барорефлекторногомеханизма,контролирующего ЧСС, а также активность почечногосимпатического нерва, определяли прив/в введении фенилэфрина инитропруссида натрия (6-12мкг/мин; 1-2 мин). Определяли ЧСС- исходные и на уровне платореакции АД.ПоказателиЧСС и АД усредняли по данным 2-3 измерений отрицательных иположительных хронотропных эффектовсоответственно для каждогоживотного. Определяли изменения амплитуды интегрированной за 1 с активностинерва при смещениях АД навеличины ±25 и ± 50 мм рт.ст. По результатам измерений длякаждой группы экспериментальных животных расчитывалиуравнения регресcии у=ах+в (Origin 6.0), гдекоэффициент а (наклон линии регресии;уд/мин мм рт.ст.) характеризовалбарорефлекторную чувствительность (Kent et al.,1972).

Исследование вариабельностисердечного ритма Проводилиспектральный анализ длительностей R-Rинтервалов, полученых наоснове телеметрической записи ЭКГ у крысSprague-Dawley и SHR, на основе частотного домена. Делали 5-ти минутные записи ЭКГво время снаживотных. R-R интервалы ЭКГ выделяли припомощи программы «Анализ» основногопрограммного пакета (DSI),переводили в текстовыйформат (ASCII) и экспортировали в программуанализа ВСР (Университет Куополо, Финляндия).Программа позволяла провестипараметрический (ауторегрессивный) анализнаряду с непараметрическим (быстрыепреобразования Фурье) и вычислитьпиковые частоты и мощности частотныхкомпонентов – ОНЧ(очень низкие частоты;0,004-0,05 Гц), НЧ(низкие частоты; 0,05-0,15 Гц) и ВЧ (высокиечастоты; 0,15-0,35 Гц), а также соотношение мощностей НЧ/ВЧ.Показатели ВСР исследовали увзрослых Sprague-Dawleyа также у спонтанно гипертензивных крыс,подвергавшихся в постнатальном онтогенезедействию интермиттирующей гипоксии.

Телеметрия. ПрименялисистемуDataquest® A.R.T.Gold (Data Science International, Inc., St. Paul, MN, USA) для регистрации АД, ЧСС и ЭКГ у крыс идавления в bulbus penisу мышей в условияхсвободного перемещения животных. Cистема включалареферентныймонитор внешнего давления (APR-1),устройствообмена данных (Data Exchange Matrix),воспринимающие устройства(RPC-1), на которыхрасполагались индивидуальные контейнеры с животными. Телеметрическиедатчикимоделей DSI PhysioTel® иТА11С50-РХТ и ТА11PA-C40 (для крыс)размещаливнутрибрюшинно, кончиккатетера для измеренияАД располагали в аорте.Электроды для ЭКГ, связанные стелеметрическим трансмиттером, подкожноподшивали к участкам тела в соответствии с положением 2-го стандартного отведения.

Дляисследования половой функции у мышейиспользовали оригинальнуюавторскую модель телеметрии эректильной функции in vivo. Трансмиттер ТА11РА-С20располагался внутрибрюшинно, кончик катетерадля измерения давления при эрекцияхполового члена мыши вводили в bulbus penis.Исследовали давление в ходеспонтанных эрекций, а также вповеденческих тестах с самками (контактных ибесконтактных). Проводили непрерывный мониторингспонтанных эрекций 2 дня/нед в условияххронической ИГ в течение 8 недель. Контактные ибесконтатные тесты с самкамипроводили через 5-8 недель применения ИГ. В условиях ИГисследовали влияние на половую функцию тадалафила (Сialis; 0.014мг /25г веса тела мыши, чтосоответствует 40 мг/70кг веса человека; Eli Lilly, Indianapolis).

Конфокальнаямикроскопия. Дляморфологическогоисследования эфферентныхокончаний блуждающего нерва в правом предсердии крысам была сделана серияунилатеральных инъекций трейсерародамина(№ 3886; MolecularProbes, Eugene, OR) в nucleus ambiguus (NA) в девяти точках (-1,600 до + 1,600 мкм, сшагом 400 мкм; общий объем 22.5-112.5 нл). Флюорохром (1 мл, 2мг/млв/б; Fluoroсhrome LLC, Denver, Co) был введен дляконтрастной окраски клетокинтрамуральныхпредсердныхганглиев.Количественно оценивали эфференты блуждающего нерва с помощью конфокального микроскопа Lieca ицифровой системы оценки параметров изображенияNeurolucida (MicroBright Field, Colchester, VT, USA).

Исследованиясодержания катехоламинов в плазме крови,нейроэндокринных тканях и симпатическихганглиях. Содержаниекатехоламинов – адреналина инорадреналина, а также дофамина, дигидроксифенилуксуснойкислоты и5-гидрокситриптамина в экстрактах каротидных телец,краниального шейногосимпатического ганглия инадпочечников у крыс определялиметодом высокоэффективной жидкостнойхроматографии.

Исследование ферментов синтезакатехоламинов в экстрактахкаротидных тел, надпочечников и краниальногошейного симпатическогоганглия.Экспрессию тирозингидроксилазы и ее фосфорилированных форм,дофамин-гидроксилазы, фениэтаноламинN-метилтрансферазы и ГТФциклогидролазы-1 определяли методом иммуноблота (Western Blot).

Cтатистика. Применяли общепринятые методывариационной статистики, результатываражаликак среднее ± m. При оценкеразличий использовали парный и непарныйтест Стьюдента-Фишера, тест ANOVA, тест Wilcoxon’a,регрессионныйанализ, спектральный анализсердечного ритма. Различиясчитали статистически значимыми приP<0.05.Использовали пакеты программ DSI Analysis (DSI, St. Paul, MN),Buxco Analysis (Buxco Electronics Inc., Troy, NY),Мicrosoft Excel,Origin 6.0 (OriginLab Corp.,Northampton, MA), Neurolucida (MBF Neuroscience, Сolсhester, VT),SoftMax Pro (GMI, Inc,Ramsay, MN).

РЕЗУЛЬТАТЫИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Пре- и постнатальная интермиттирущая гипоксия исердечно-сосудистая функция

1.1 Барорефлекторнаячувствительность взрослых крыс после перинатальной интермиттирущей гипоксии.

Барорефлекс представляет собоймеханизм поддержанияпостоянного АД,определяемый активностью барорецепторовпри колебаниях АД.Его механизм включаетафферентное звено (барорецепторы), центральноезвено (ядро nucleus ambiguus и симпатические центры, связанныес ростральной вентролатеральной медуллой),эфферентные блуждающие нервы и симпатическиевазоконстрикторы и эффекторныеорганы - сердце и сосуды. Чувствительноть барорефлекса–интегральный показатель, отражающийстатус механизмов контролясердечно-сосудистой функции.

Парасимпатическая иннервациясердца играет ведущую роль в рефлекторнойрегуляции ЧСС в покое.Отсроченные сердечно-сосудистые эффекты перинатальнойинтермиттирующей гипоксии изучали накрысах Sprague-Dawley,которых подвергали действию гипоксии впостнатальные дни 1-30 или пренатальныегестационные дни 5-21 (беременныекрысы).Барорефлекторнуючувствительность (БРЧ) и сердечныехронотропные эффекты измеряли в возрасте 3.5 - 5 мес у анестезированных животных,при в/ввведениифенилэфрина и нитропруссида натрия (6-12мкл/мин, 1-2 мин). Контролемслужилиживотные, постоянно содержавшиеся вусловиях нормоксии. БРЧ измеряли до и после применения 18 -мин острой ИГ. Постнатальная ИГ приводила к нарушению (снижению) барорефлекторнойчувствительности у взрослых крыс, которая, по сравнению сконтрольными, была наполовину ниже в покое и не изменялась после остройИГ (Рис.1). У контрольных животных после острой гипоксии БРЧ снижалась на 42% (Р<0.05). Реакция ЧСС навведение фенилэфрина у крыс с постнатальной ИГ быламеньше, чем у контрольных(Р<0.05) и не изменяласьпосле острой ИГ.

Рис. 1.Барорефлекторнаяфункция 3.5-5-месячных крыс, выращенных вусловиях нормоксии (контроль),постнатальной и пренатальнойинтермиттирующей гипоксии(n=6/группу).

Барорефлекторная чувствительность у крыс с пренатальной ИГ быласходнойс величинами у контрольных крыс (Рис. 1), однакохронотропные влияния на сердце были снижены. Представленные данные свидетельствут о долгосрочныхпоследствияхинтермиттирующей гипоксииперинатального периода для контроля сердечно-сосудистой функции.

1.2 Исследование проекций блуждающегонерва к сердцу.

Нейроморфологичекие исследованияэфферентных проекций вагуса ксердцу при введенииродамина в левый nucleus ambiguus у крыс показали,что пучок эфферентных волоконблуждающего нерва в предсердном ганглииформирует гроздь окончаний, обхватывающихганглионарные нейроны множеством варикозныхтерминалей наподобие корзинки.В отличие от контрольных животных, меченыеродамином корзинчатые окончания у крыс,подвергавшихсяпостнатальной ИГ представлены более редко. Вставкина левой панели B (нормоксия) и правойпанели A (ИГ) представляют собой составленныес помощью программы Neurolucidaизображения-реконструкции корзинчатых окончаний вокругнейронов, показанныхстрелкой (Рис. 2).

.

Рис. 2. Примерыконфокальных изображений иннервацииганглионарных клеток предсердий у 2-месячных крыс - контрольной (правыепанели) ипосле 30-дневной постнатальнойинтермиттирующей гипоксии(левыепанели).Шкала: 50 мкм.

ИГ впервые 35 днейпостнатальной жизни вызвала у 2-месячныхкрыс уменьшение числа корзинчатых контактов на 17%(Р<0.001) и число варикозных окончанийаксонов вагуса на 56% (Р<0.001) по сравнению сконтролем.Такие изменения эфферентнойиннервации сердца могут определять барорефлекторные дефициты и лежать восноведолгосрочных модификаций барорефлекторнойфункции,обусловленных постнатальнойинтермиттирующей гипоксией.

1.3Влияниеинтермиттирующей гипоксиина центральные механизмыбарорефлекса.

У взрослых крыс Fischer 344, подвергавшихся30-55 - дневнойИГ, микроинъекции L-глутамата (10мМ; 20нл) в область nucleus ambiguus вызывали менеевыраженные сниженияЧСС, чем у контрольныхкрыс. Электрическая стимуляциядистальногоучастка перерезанногоблуждающего нерва (1-30 Гц, 0.5 мА, 20с) у крыс после ИГ показала уменьшение времени достижения 50%максимального хронотропногоэффекта по сравнению сконтролем, чтопозволяло исключитьвозможность нарушений кабельной функциинерва иуказывало на изменения вцентральных нейротрансмиттерныхмеханизмах ядра вагуса какна причинуснижения барорефлекторнойчувствительности. Действительно,показано, что ИГ приводит кэксайтотоксичности глутамата, что может нарушатьНМДА-рецепторно-Са2+канальцевые комплексы намембранах нейронов, приводяк усилению поступления Са2+ вклетку и последующей ее гибели (Ikonomidou et al.,1999).Количественная оценкаокрашенных по Нисслю преганглионарных кардиомоторныхнейронов nucleus ambiguus на 5 корональных срезах продолговатогомозга показала достоверноеснижение их числа у крыс после ИГ (Таблица 1).

Таблица 1

Число окрашенных поНисслю нейронов в Nucleus Ambiguus после30-дневной интермиттирующей гипоксии

-800 -400 0 +400+800 Общее

Лев ПравЛевПравЛевПрав ЛевПрав ЛевПрав

Контроль 55.3 57.160.359.5 45.644.5 68.270.482.783.8627.4

± 2.1±2.6 ± 5.3 ± 6.5± 3.4 ± 3.2 ± 10.5± 8.7± 9.7 ±10.8± 23.5

ИГ 34.735.736.133.931.232.335.636.5 45.1 46.7367.8

± 3.0* ± 4.1* ± 3.7* ± 2.6*± 2.8* ±2.1* ± 4.0* ± 5.1* ± 4.8** ± 3.5** ± 11.6**

**, P<0.01; *, P<0.05 при сравнении сконтрольными (среднее ± m).Срезы мозга относительно obex.

1.4 Интермиттирующая гипоксия и симпатическиемеханизмы контроля АД.

Каротидныехеморецепторы, реагирующие нагипоксию,связаны с механизмами контроля активности симпатической нервной системы ипродукции катехоламиновмозговым веществом надпочечников. Былиисследованы отсроченные эффектыпостнатальной ИГ на показателиактивности симпатической нервнойсистемы.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»