WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 7 | 8 || 10 | 11 |   ...   | 13 |

1,10

3600

При синтезебольшинства веществ микроорганизмынуждаются в неорганическихфосфорсодержащих соединениях в видефосфат-ионов. Они необходимы для ростамикроорганизмов, синтеза многих жизненноважных соединений. Следуетотметить, что избыток фосфатов обычноблагоприятно влияет на рост биомассы,способствует ассимиляцииуглеводов, если фосфат выступает какаллостерический регулятор некоторыхферментативных реакций (Novak et al., 1997; Andersen et al., 2001). Однако,во время синтеза, отдельные этапы которогоподвержены отрицательному влияниюфосфатов, накопление бактериоцинаначинается с момента, когда содержаниефосфата в среде снижается (Yother et al., 2002).Изменяя содержание калия фосфорнокислогоот 2,0% до 0,5%, мы наблюдали изменениединамики роста штаммов 194 и F-116, а также иуровня антибиотической активностикультуральной жидкости (табл.11). Приуменьшении количества фосфата в среде от 2%до 0,5% рост культур и синтез бактериоцинаснижался.

Существует корреляциямежду концентрацией фосфора в среде ииспользованием углеводов из средыкультивирования (Безбородов, 1991; De Vuyst, 1994;Chan et al., 2002). Изучение роста и развитиялактококков на средах, содержащих 1,0 - 0,5%КН2РО4 в сочетании судвоенным содержанием сахарозы илиглюкозы, показало, что за 9 часовинкубирования в среде с 2% глюкозы уровеньактивности увеличился на 13,8%, при заменеглюкозы на сахарозу уровеньантибиотической активности увеличился на24,6%. Дисахарид сахароза - наиболееблагоприятный углевод для синтезабактериоцина.

Внесение вферментационную среду с уменьшеннымсодержанием КН2РО4 (1%) 70мг% дрожжевого автолизата, 2 % сахарозы и 0,01 %изолейцина способствовало повышениюуровня бактериоцинпродуцирующейактивности штамма L.lactis subsp. lactisF-116 на 60%.

Оптимальной средой для штамма 194была среда, содержащая 0,5 % КН2РО4, 2% сахарозы и 0,01%аспарагиновой кислоты, что способствовалоповышению синтеза бактериоцина на 59%. Итак,достижение максимального уровнябактериоцинобразующей активностипроведено путём оптимизации составаферментативной среды по фосфору, азоту иуглероду.

Табл.11. Влияниеразличных концентраций фосфата вферментационной среде с дрожжевымавтолизатом и без него на рост L.lactis subsp. lactis штамма 194 исинтез бактериоцина.

Состав среды

Биомасса, ОП540

рН

Активность, МЕ/мл

Контроль (1,0% глюкоза + дрожжевойавтолизат + 2,0% KH2PO4)

1,45

4,2

3600±18,5

с 1,0%KH2PO4

1,05

4,0

3150±14,3

с 0,5%KH2PO4

0,80

3,9

3000±12,0

безKH2PO4

0,32

5,7

800±6,5

бездрожжевого автолизата

0,18

6,6

0

рН-статированиеферментационного процесса науровне 6,0 способствовало увеличениюсинтеза бактериоцинов лактококками. Витоге синтез бактериоцина штаммом F-116 былувеличен в 1,9 раза, а штаммом 194 в 1,8 раза (8200и 6400 МЕ/мл) соотвественно (табл.12).

Табл.12.ВлияниерН-статирования ферментационной среды нарост культуры и синтез бактериоциновприродным штаммом Lactococcus lactissubsp. lactis 194 и гибриднымштаммом F -116.

Время, час

Показатели

рН

ОП540

Активность,

МЕ/мл

шт.194

F - 116

шт.194

F - 116

0

6,8

0,28

0,20

0

0

3

5,9

0,40

0,32

1700

2050

4

5,6

0,52

0,60

2400

2900

5

6,0

0,80

1,05

3200

4100

6

6,0

1,30

1,34

4200

5840

7

5,9

1,50

1,58

4800

6500

8

5,9

1,60

1,60

5800

7600

9

6,0

1,60

1,66

6150

8200

10

6,0

1,60

1,70.

6400

8200



ДиссоциацияпродуцентовбактериоциновLactococcuslactissubsp.lactis

Интерес представляетизучение диссоциации бактерий штамма 194,отобранного по признаку высокого уровня иширокого спектра антимикробного действия.Было установлено, что этот штамм наагаровой оптимизированной средедиссоциировал на G (мелкие, прозрачныеколонии) и S (крупные, белые колонии). Причёмвариант G доминировал, составляя около 88% отобщего числа анализированных колоний.Более высокой активностью обладали клоны,образующие колонии G-фенотипа. Возможно,что меньший размер и плотность колонийболее активных вариантов отражаетспособность данной клеточной популяцииэффективнее осуществлять функциюпродукции химических веществ сантимикробным действием, что влияет и нарост самой бактериальной популяции.Диссоциация штаммов L. lactissubsp. lactis на G и S вариантыимела местопри множественных пассажахна агаровых средах с глюкозой. Наиболееактивными по бактериоцинсинтезирующейактивности являлись G-варианты. УG-диссоциантов природного штамма 194широкого спектра антимикробного действияактивность по низину составила 4500 МЕ/мл, полевомицетину –1630 ед/мл, а фунгицидная активность,рассчитанная по нистатину, – 2200 ед/мл, что на 35,4,21,8 и 48,5% (соответственно) выше по сравнениюс активностью S-вариантов. Гибридные штаммыподвержены диссоциации в меньшей степени.Полученные данные по диссоциациипродуцентов позволят проводить егоселекцию по целевому признаку.

Оптимизацияспособов хранения штаммов  Lactococcus lactis subsp.lactis— продуцентовбактериоцинов.

Важной проблемой,решение которой необходимо дляобеспечения эффективностибиотехнологических производств, являетсяразработка способов длительного хранениякультур-продуцентов, обеспечивающихстабильность их жизнеспособности,таксономических показателей и уровня ихфизиолого-биохимической активности.

Табл. 13. Влияниесостава защитной среды на выживаемостьLactococcus lactis

subsp.lactisгибридного штамма F-116 впроцессе лиофилизации.

Состав защитной среды,

Количество лактококков/ мл

Долиофилизации

Послелиофилизации

Сахароза,20%.

1,691010

7,9109

Сахароза, 10%+ желатина, 5%

1,521010

1,061010

Сахароза,10 %+желатина, 1 % + глутамат натрия, 1% + цитратнатрия, 0,5%

1,461010

1,301010

Лошадинаясыворотка, 30%

1,811010

8,6109

Сывороточный альбумин, 10%

1,761010

6,9109

Обезжиренное молоко (обрат)

1,71010

8,2109

В зависимости отсостава защитной среды выживаемостьштамма F-116 варьировала от 30% до 90% (табл. 13). Влиофилизированной культуреантибиотическая активность сохраняется науровне исходной при использованиизащитной среды на основе сахарозы,желатины с добавлением глутамата ицитрата. В процессе лиофилизацииколичество жизнеспособных клетокизменилось незначительно: выживаемостьсоставила в среднем 40 - 50%. Наибольшийуровень выживаемости клеток наблюдали уштамма 194, которая составляла 51,6%,наименьший – уштамма МГУ –40,5%. Наблюдалась некоторая тенденция кснижению антибиотической активности улиофилизированных культур, что, возможно,связано с повреждением нуклеиновых кислот,внутриклеточных белков, пептидов впроцессе лиофилизации (Демина, Лысенко, 1989),либо с накоплением в популяции неактивныхдиссоциантов (Милько, Егоров, 1992; Милько идр., 2007), которая может иметь место прианабиозе культур. Однако после второго,третьего пассажей культур в обратефизиолого-биохимическая активностьизучаемых штаммоов полностьювосстановлена: плотный молочный сгустокобразовался через 10 часов инкубирования,антибиотическая активность достиглаисходного уровня (до лиофилизации).

Результатыисследования свидетельствовали, чтолиофилизация обеспечивала длительнуюжизнестойкость культур молочнокислыхбактерий (до 24 лет). Для полноговосстановления физиолого-биохимическихсвойств лиофильно высушенных культуртребовалось подращивание их в обрате какэлективной среде их обитания.

Выполненные токсикологическиеисследования наэкспериментальных животных показалиотсутствие токсичности у новых выделенныхштаммов: низинобразующего штамма 119х,гибридного штамма F-116, штаммов № 10, 25, 52,полученных в результате индуцированногомутагенеза (Заключения о патогенностиимеются в приложениях кдиссертации).

Выделение,очистка и идентификация бактериоцинов,синтезируемыхперспективнымиштаммамиL. lactis subsp.lactis.

Разработана схемавыделения и очистки новых бактериоцинов,синтезируемых лактококками, включающаяэкстракцию, реэкстракцию и кристаллизацию(Стоянова и др., 2007).

Сравнительное изучениебактериоцинов, образуемых штаммами L. lactis subsp. lactis разногопроисхождения показало, что бактериоцины,синтезируемые штаммами 119х и штаммом МГУ,по физико-химическим свойствам неотличались от низина А, обладали основнымисвойствами, мигрировали к катоду, являлиськатионными полипептидами, былитермоустойчивы (рис. 12).

Из культуральнойжидкости гибридного штаммаL. lactis subsp.lactis F-116 был выделен антибиотический комплекс,представляющий собой сложную смесьбиологически активных компонентов исостоящий из фракций ЛГС-Н, ЛГС-С и ЛГС-В.

Рис.12. Тонкослойнаяхроматография бактериоциноподобныхкомплексов, продуцируемых гибриднымштаммом Lactococcus lactis subsp. lactis F-116, его родителями в сравнении снизином и низинобразующими штаммами МГУ и119х. СистемаMeOH-H2O (96:4).Биоавтография на пластинках “Silufol”,тест-организм - B.coagulans.

Физико-химические ибиологические свойства компонентовантибиотического комплекса,синтезируемого гибридным штаммом F-116представлены в таблице 14.

Табл. 14.Физико-химические и биологическиесвойства компонентов

антибиотическогокомплекса, образуемого штаммом L. lactis subsp. lactis F-116

Свойства

Компоненты


ЛГС-В

ЛГС-Н1*

ЛГС-Н*

Pages:     | 1 |   ...   | 7 | 8 || 10 | 11 |   ...   | 13 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»