WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 5 | 6 || 8 | 9 |   ...   | 13 |

Табл. 7.Антимикробный спектр действияродительских штаммов Lactococcuslactis subsp.lactis 729, 1605 и их гибридов F-116, F-118,F-119, F-146


Тест-культура

Ш т а мм ы

729

1605

F-116

F-118

F-119

F-146

Диаметр зон подавления роста,мм

Micrococcusluteus

10

12

30

23

28

23

Bacillussubtilis

10

12

22

22

22

21

Bacilluscoagulans

9

10

26

20

27

22

Staphylococcusaureus

0

12

21

20

20

19

Alcaligenesfaecalis

9

11

22

17

21

17

Serratiamarcescens

0

9

21

18

20

17

Escherichiacoli

0

11

18

15

19

14

Comomonasterrigena

0

10

18

16

18

16

Aspergilusniger

0

9

17

12

19

16

Fusariumoxysporum

0

9

14

14

15

14

Candidaguallermondii

0

9

14

20

18

20

Rhodotorulaaurantiaca

0

0

16

14

17

14

Примечание: (Р. 0,05).

Свойства рекомбинантов стабильносохранялись после рассева и выделенияиндивидуальных колоний. При слияниипротопластов происходит перенос какхромосомной, так и плазмидной ДНК, врезультате чего формируются негетерокарионы, а истинныерекомбинанты.

Электрофоретическийанализ плазмидных профилей гибридныхштаммов F-116 и F-119 показал наличие у них какродительских, так и приобретенных плазмид.Родительский штамм 729 имел 5 плазмидразмером 11,4; 7,7; 2,6; 2,1 и 1,8 МДа, а штамм 1605– 2,0; 3,8; 5,0; 8,0; 35МДа. Гибридные штаммы, полученные прислиянии протопластов, имели плазмиды 11,4; 9,5МДа и более мелкие плазмиды в разныхкомбинациях, присутствующие в обоихродителях. Однако штамм F-116 имел плазмиду 10МДа, у штамма F-119 отсутствовали плазмиды 7,7и 5,0 МДа, т. е. этот штамм потерял по одной изродительских плазмид (рис.8).

Рис. 8.Плазмидный профиль штаммов Lactococcus lactis subsp. lactis.

При компьютернойобработке результатов секвенированиягенов 16S рРНК и сравнительном анализеполученных нами последовательностейполученных гибридных штаммов споследовательностями тех же геноввышеуказанных типовых штаммов между нимиобнаружилось высокое сходство. Гибридныештаммы F-119 и F-116, показали 100%-ное сходствофрагментов генов 16S рРНК с референтнымштаммом L. lactissubsp. lactis АJ4I9572,штаммом МГУ и их родительскими штаммами 729и 1605 (рис.2).

Использование методаслияния протопластов показало егоперспективность для получения штаммовлактококков с повышенной антимикробнойактивностью и расширенным спектромантимикробного действия. Выделен новыйстабильный гибридный штамм L.lactis subsp. lactis F-116 с активностью4200 МЕ/мл, что в 12-14 раз выше активностиродительских штаммов. Высокая частотавозникновения вариантов, превышающих поактивности исходные штаммы, делает данныйметод весьма перспективным дляиспользования в процессе поддерживающейселекции, обогащения популяцииштаммов-продуцентов бактериоциновактивными вариантами.

Индуцированныймутагенез лактококков Lactococcus lactis subsp. lactis.

Изучениезакономерностей спонтанной ииндуцированной мутагенами изменчивостимикроорганизмов по синтезу бактериоцинов,разработка условий, повышающихэффективность действия мутагена, имеетисключительно важное теоретическое ипрактическое значение.Эффективной дозой облученияУФЛ интактных клеток штамма 119 следуетсчитать дозу 76 тыс. эрг/мм2, что соотвествовалоэкспозиции в 10 мин (табл.8).

После облучения икультивирования на среде с низиномнаблюдали следующую сегрегацию клонов поантибиотикообразованию: 30% обладалиантибиотической активностью от 1500-2000 МЕ/мл,40% от 2500-3200 МЕ/мл и 15% «+ вариантов» от 3080-3800МЕ/мл, т.е. произошло увеличение активностина 40,4% (рис.9). В популяции отсутствоваликлоны, чувствительные к низину. Довольновысокая концентрация низина замедляетрост микроорганизмов, но оказывает иселективное действие (Литвинова, Силева идр.,1976; Kim et al., 1997).

Табл. 8.Выживаемость Lаctococcus lactis subsp. lаctis 119 взависимости от времени УФ-облучения


Время облучения,

мин

Распределение вариантов понизинсинтезирующей активности,%

Потеряли активность

Нижеуровня контроля

Уровень контроля

«+»варианты

0

0

29,0+1,1

71,0+3,0

0

1

12,2+0,7

37,5+2,2

50,3+2,1

0

5

29,3+1,2

36,3+2,7

34,2+1,3

0

10

50,1+2,3

12,0+0,5

25,6+0,9

12,0+0,7

Примечание:к-«+-вариантам» относили клоны,продуктивность которых была выше поотношению к исходной.

АБ

ВГ

Рис. 9. Сегрегацияклонов штамма Lаctococcuslactis subsp. lаctis 119 понизинобразующей активности при разныхдозах УФЛ: А —спонтанная изменчивость; Б — сегрегеция клоновна среде с низином; В — сегрегеция клоновпри обработке УФЛ в течение 10 мин; Г — сегрегеция клоновпри двойной обработке УФЛ по 10 мин.

Максимальноенакопление низина (4100 МЕ/мл) достигнуто приобработке НЭМ-ой в течение 90 минут иинкубирования штаммов на селективнойсреде с низином (рис. 10). В результатекомбинированного воздействия УФЛ и НЭМ наштамм 119 был отобран вариант № 25 сантибиотической активностью, на 60 %превышающей активность исходного штамма,что составило 4200 МЕ/мл. Данный штаммприобрел способность к утилизациираффинозы, использовал сахароспирты, чтоне характерно для мезофильныхгомоферментативных лактококков. Варианты№ 8, полученный однократным воздействиемУФЛ, и № 6, полученный обраработкой НЭМой)после лиофилизации и 10 пассажейреветировали к исходному штамму 119 поуровню антибиотической активности испектру сбраживаемых углеводов.

аб

в

Рис. 10. Сегрегацияклонов штамма Lаctococcus lactis subsp. lаctis 119 понизинобразующей активности при обработкехимическими мутагенами:

а - сегрегеция клоновпри обработке протопластов НГ-ом; б – сегрегеция клоновпри обработке интактных клеток НЭМ-ой; в– сегрегецияклонов при комбинированной обработкеинтактных клеток УФЛ в течение 10 мин иНЭМ-ой.

Стабильные вариантыбыли получены в результатедвухступенчатого воздействия УФЛ иликомбинированного воздействия УФЛ, НГ и НЭМна протопластированные клетки штамма 119(варианты № 10, 11, 25 и 52 снизинсинтезирующими активностями, до 70 %превышающими активность исходного штамма.Полученные варианты ускорилиферментационный процесс синтезабактериоцинов, изменили спектрсбраживаемых углеводов и устойчивость каминогликозидным антибиотикам,ингибирующих синтез белка, а именно:сизомицину и канамицину. Мутантные штаммыбыли низинобразующими. Из этих штаммовступенчатым воздействием УФЛ был отобранмутантный штамм № 10 для исследований поразработке технологии получения низина.Этот мутантный штамм на базовой среде сглюкозой, разработанной в лабораторииантибиотиков (Баранова и др., 1974),синтезировал низин с активностью 3850 МЕ/мл.

В промышленных условияхдля получения низина обычно используютсреды, содержащие молоко и молочныепродукты, богатые аминокислотами ивитаминами. В качестве источников углероданередко применяют картофельный крахмал,кукурузную муку или другие растительныематериалы, отходы ферментативногопроизводства (Лапинска, 1974; Кудряшов и др.,1995).

Использование в качествеферментационных субстратов отходовбиотехнологическихпроизводств.

Из данных,представленных в таблице 10, видно, что всеиспытанные отходы биотехнологическихпредприятий могут быть использованы дляпроизводства пищевого консерванта низина,но лучшими из них являются сыворотка ипермеат культуральной жидкости A. awamori -отход при производствеглюкоамилазы.Уровень низина на основе этого пермеатавсего на 4% ниже, чем на сыворотке и достигал72% по отношению к контролю (обезжиренномумолоку). Добавление 0,5% глюкозы увеличивалонакопление низина до 77,5%, что дажепревысило уровень синтеза низина на основесыворотки, используемой английской фирмой«Aplin & Barrett, LTD» при производстве препарата«Nisaplin». Использование в качествеферментационных субстратоввышеперечисленных отходов представляетреальную возможность эффективного решенияпроблемы защиты окружающей среды приодновременном удешевлениитехнологического процесса синтеза низина.Но все же наиболее перспективными длябиотехнологии следует считать штаммы,синтезирующие бактериоцины, отличные отнизина, обладающие широким спектромантимикробного действия.

Табл. 9. Накоплениенизина Lactococcus lactis subsp. lactis штаммом 10 на субстратах,представленных отходамибиотехнологических производств сдобавками глюкозы.

Субстрат

РВ*,

мг/мл

Общийазот,

мг/мл

Амин-

ный азот,

мг/мл

Фосфор,

мг/мл

Сухие

вва,

%

Зольные

вва,

%

Накопление

низина,

% (к контролю)

Pages:     | 1 |   ...   | 5 | 6 || 8 | 9 |   ...   | 13 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»