WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 4 | 5 || 7 | 8 |   ...   | 13 |

119

1605

Оптическая плотность, ОП650

0

1,21

1,15

0,97

0,95

1,10

1,08

0,76

0,79

0,99

1,01

10

1,18

1,15

0,80

0,79

0,91

0,96

0,65

0,66

0,91

0,94

20

1,17

1,13

0,40

0,61

0,73

0,82

0,48

0,58

0,85

0,86

30

1,12

1,07

0,26

0,45

0,65

0,78

0,40

0,55

0,64

0,78

Осмотический

шок

1,03

0,99

0,12

0,27

0,21

0,13

0,28

0,39

0,005

0,07

. Аминокислота, поступаяизвне и включаясь в синтез пептидогликанапо типу сродства к аланину или другиммукополимерным аминокислотам, ингибируетобразование связей между пептиднымисубъединицами. Блокирование синтезамономера с последующей остановкой синтезаполимера ведет к ингибированию ростамикроорганизма и образованию«ослабленной» клеточной стенки,аминокислота как бы подготавливает клеткук действию литического фермента. Определеныминимально ингибирующие рост концентрацииглицина, глутаминовой кислоты, лизина иDL-треонина для протопластированиялактококков, отличающихся понизинсинтезирующей активности (табл. 4).Наиболее благоприятным дляпротопластирования было предварительноевыращивание лактококков в среде сDL-треонином в концентрации 0,1% для штаммаМГУ и 0,2% для штаммов 119 и 1605, чтоспособствовало получению до 98%протопластов

Рис. 3. Изменениеоптической плотности бактериальныхсуспензий штаммов Lactococcuslactis subsp. lactis729 и 1605 в лизирующей смеси саммонийно-цитратным буфером и вдистиллированной воде (а). 1 - штамм 729; 2 -штамм 1605.

А Б

В

Г

Рис. 4. Электронныемикрофотографии Lactococcuslactis subsp.lactis штамм 119:

А — интактные клетки,выращенные в биосинтетической среде;Б — интактныеклетки, выращенные в той же среде сдобавлением 0, 2% DL- треонина; В - протопластыв лизирующей смеси; Г - L-формы (увеличение 1х40000,1х15000).

Из 7-ми буферных системдля стабилизации протопластов наиболееэффективным для формирования протопластовоказался стабилизирующий буфер,приготовленный на основе натриялимоннокислого, хлористого аммония и ЭДТА(рН 6,4). По-видимому, сказалось действие ЭДТАи цитрата. По разнице ОП650 суспензиипротопластов в аммнонийно-цитратномстабилизирующем буфере и в воде судили остепени протопластирования. Процесспротопластирования контролировали вфазово-контрастном микроскопе МБИ-15 и подействию осмотического шока (рис. 3).

В процессепротопластирования интактные клеткипревращаются в протопласты. Цепочкистрептококков разрываются, овальная формаих переходит в сферическую. В поле зренияэлектронного сканирующего микроскопа (рис.4) виднымножественные отдельные протопластыхарактерной формы, очевидно отсутствиеклеточной стенки. Но, следует отметить, чтопроцесс протопластирования происходит неповсеместно. Имеются клетки с неполнымлизисом клеточной стенки, так называемыеL–формы.

Рис. 5. Уровеньантибиотической активности штаммов Lactococcus lactis subsp. lactis послепротопластирования и регенерации.Примечания: 1 — интактные клетки; 2 — протопласты;3 —регенерированные в среде с ПЭГ; 4 — регенерированные всреде с ПЭГ и микродозами лизоцима.

Установлено, что протопластирование,регенерация и реверсия протопластов кклеточной форме, может служить методомповышения синтеза бактериоцинов:низкоактивные штаммы 729 и 1605 увеличилисинтез низина в 3 раза (рис.5).При этом популяция потеряласпособность к утилизации лактозы игалактозы. Уактивных штаммов-продуцентов этиизменения не были столь очевидны, анезначительное повышение (5 - 6%) может бытьследствием высвобождения низина приразрушении клеточной стенки.

Внесениемикроколичеств ПЭГа способствуетнезначительному повышению уровнянизинообразования у протопластов штаммов729 и 1605 на 15-20%. ПЭГ способствует агрегациипротопластов, их слиянию, вызываетнекоторое увеличение антибиотическойактивности. Инкубирование протопластов смикродозами лизоцима выявило образованиеL– форм, укоторых синтез бактериоцинов увеличилсяна 22- 30% (у штаммов 1605 и 729) и на 6% у активногонизинсинтезирующего штамма 119х.

Протопластированиелактококков, регенерация протопластовпривели к наследственным изменениям,которые могут быть связаны с экспрессиейгенов, а также с проявлением действия«молчащих» генов, что обнаружилось вфенотипе культур с низкой антибиотическойактивностью. Нельзя такжеполностью исключить внутриштаммовоеслияние протопластов и, соответственно,рекомбинантные явления перед регенерациейпротопластов. Таким образом,протопластирование можно рассматриватькак метод селекции микроорганизмов

Цель следующего этапаработы состояла в получении новыхгибридных штаммов L.lactis subsp. lactis с помощью методаклеточной инженерии -слияния протопластов. Дляобразования рекомбинантных форм врезультате слияния протопластовнеобходимы по крайней мере три процесса:цитоплазматическое взаимодействие,взаимодействие ДНК - ДНК, реверсияклеточной формы.

В таблице № 5 обобщеныотличительные физиолого-биохимическиепризнаки шгаммов, что послужило основойдля составления селективных сред прикультивировании и отборе полученных врезультате слияния протопластоврекомбинантов. Необходимым условиемотбора адаптивных рекомбинантов являласьих исходная неспособность образовыватьколонии на данной селективной среде (ссахарозой, низином, фузидиевойкислотой).

Табл. 5. Отличительныепризнаки штаммов Lactococcuslactis

subsp. lactis,отобранных для слиянияпротопластов.

Штаммы

Признаки

Антибиотическая активность,МЕ/мл

729

Asn-,Mal-, Suc+, Fuzr, Niss

300±12,5

1605

Asn+, Mal+,Suc-, Fuzr, Niss

500±18,9

119

Asn-,Mal-, Suc+,Fuzr, Nisr

2650±72,4

МГУ

Asn+,Mal+, Suc+, Fuzs, Nisr

1980±67,8

В результатеисследований по разработке методикислияния протопластов было установлено, чтореверсия к клеточной форме зависит отсостава компонентов среды. При слиянии сиспользованием ПЭГ в сочетании с 0,6 М КСlреверсия не произошла, а при использовании0,6 М глюкозы или сахарозы реверсия имеламесто.

Количество колоний впервом варианте опыта с использованием вкачестве фузагена ПЭГ с глюкозой прислиянии штамма 729 со штаммом 1605 составило 3,2x102, а сиспользованием глицина и СаС12 - 5,9х101. Полученные гибридыобладали способностью к сбраживаниюарабинозы, мальтозы, раффинозы, аантибиотическая активность популяцииподнялась до уровня активных продуцентов(5150 МЕ/мл).

Во втором вариантеопыта, где для слияния были взяты мутантныйштамм 1605 и дикий, активныйнизинообразователь штамм 119, количествоколоний на полноценной среде с глюкозойсоставило 1,3x104,с глицином и СаС12 - 3х102, сактивностью популяции 3220 МЕ/мл, популяцияприобрела устойчивость к низину ифузидиевой кислоте.

В третьем варианте прислиянии штаммов 119 и МГУ были полученыгибриды низин–и фузидин-резистентные с активностью 2500МЕ/мл, т. е. на уровне исходных(родительских). Количество колоний,регенерированных после слияния, сиспользованием в качестве фузагена ПЭГ сглюкозой было в 10,2 раза больше, чем ПЭГ сглицином и СаС12.

Табл. 6.Физиолого-биохимические признакипервичной популяции гибридов, полученныхпри слиянии протопластов на полноценнойсреде с глюкозой.

Родители

Признаки популяций

Антибиотическая активность,МЕ/мл

1605х729

Ara+,Mat+, NisR, FuzR

5150±76,4

119х1605

Suc+,Mal+, NisR,FuzR

3220±109,0

119хМГУ

Mal+,FusR, NisR, FuzR

2500±44,5

1605хМГУ

Mal+, Fuz,NisS

470±19,8

.

В четвертом вариантегибриды приобрели устойчивость к фузидинупо типу родительского штамма 1605, ихантибиотическая активность снизилась до 470МЕ/мл. Результаты показали, что

при слияниипротопластов активныхбактериоцинобразующих штаммов, как междусобой, так и со штаммами с низкойантибиотической активностью,высокоактивные гибриды не былиполучены. Возможно причинасостоит в недостаточной гомологии ДНК-ДНК,а также бактериоциногенности популяцийштаммов, отобранных для слияния.

Рис. 6. Распределениегибридных клонов по низинсинтезирующейактивности

после слиянияпротопластов Lactococcuslactis subsp. lactis родственныхштаммов 729 и 1605 на селективных средах с :1 -глюкозой; 2 –сахарозой; 3 –фузидиевой кислотой;

4 – низином.

Наиболее эффективныегибриды были получены при слиянииродственных штаммов с низкойантибиотической активностью: штамма 729 иего мутанта, штамма 1605. Активные клоны былиполучены при подращивании колоний послеслияния протопластов на среде с низином: 35%имели активность в интервале 2850 – 3000 МЕ/мл, 26% - от 3850 до5200 МЕ/мл (рис. 6).

Приэлектронно-микроскопическом исследованиипрепаратов слившихся протопластов штаммов729 и 1605 зафиксированы моменты агломерациипротопластов, индуцируемой ПЭГ с глюкозой.На рис.7 б нагляден начальный момент слияния -контакт двух сливающихся протопластов собразованием кратерообразного канала,через который происходит слияниецитоплазм. Электронные микрофотографииявляются иллюстративным подтверждениемсостоявшегося процесса слиянияпротопластов у штаммов лактококков.

.а б.

Рис. 7. Электронныемикрофотографии слияния протопластовLactococcus lactis subsp. lactisштаммов 729 и 1605, агломерация протопластов врастворе ПЭГ (а); процесс слиянияпротопластов (б). Увеличение 1 х 3000 и х 20000соответственно.

Штаммы, полученные слияниемпротопластов, обладали широким спектромантибактериального действия, эффективноподавляли рост не толькограмположительных бактерий, но играмотрицательных, обладали и фунгициднымдействием, что является малоизвестнымбиологическим свойством бактериоцинов,синтезируемых L. lactis subsp.lactis. Следует отметить, чтородительские штаммы гибрида имели другойспектр действия: 729 незначительно подавлялрост микрококков, но не подавлялзолотистый стафилококк, а его мутант 1605приобрел антибиотическую активность поотношению к нему, штамм 1605 избирательноподавлял рост дрожжей и мицелиальныхгрибов (табл.7).

Pages:     | 1 |   ...   | 4 | 5 || 7 | 8 |   ...   | 13 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»