WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |   ...   | 13 |

При росте в обратештаммы образовывали плотный молочныйсгусток за 8-10 час с максимальнойкислотностью рН 3,9 – 4,5, что характерно для L. lactis subsp. lactis. Исключениесоставляли штаммы 119 из простокваши и К-205из курунги, которые образовывали за это жевремя сметанообразный сгусток, поконсистенции характерный для лактококкаL.lactis subsp. cremoris. Длядифференцирования L.lactis subsp. lactisот L. lactis subsp. cremorisи от L. lactis subsp.lactis bv. diacetylactis учитывалихарактер глубинного роста на плотныхсредах с гидролизатом молока: L.lactis subsp. cremoris образуют темныекруглые колонии на поверхности среды, аL.lactis subsp. lactis bv.diacetylactis - глубинные колониинеправильной формы в виде кусочков ваты;при микроскопировании клетки имелипалочковидную форму. К тому же эти подвидыредко встречаются в природных источниках(Фостер, Нельсон, 1987).

Табл. 1. Отличительныефенотипические признакибактериоцинпродуцирующих

лактококков


Продукт

Кол-во

штаммов

Перспективные штаммы


МЕ/мл

Основные отличительныепризнаки

Курунга,

Бурятия


36

К-205


2500

Ala+;Ara+; Mtl+; Dext+; Tсs; Strr

« Doogh»,

Иран


25

IR3


3400

Ala-;Mal+; Mtl+; Dext+; Tсs; Rifs

Простокваша,

г. Москва


40

119


2700

Pro+;Ura+; Ara+; Mal+; Dext+; Rifs

Молоко коровье,

г. Москва


197

720

300

Ala-;Ura+; Mal+; Rifr; NisS

119х

3700

Ala-;Ara-; Mtl-; Dext-; Rifr

115

2500

Ala+;Suc-; Mal+ ; Dext+; Rifr

Молококоровье,

г. Клин


54

229


2200

Ala+;Ara-; Mtl-; Dext+;Rif r

Молококоровье,

Бурятия


78

194


3600

Ala+;Ara+; Xyl+; Dext+; Pnr

Молоко коровье,

Иран


35

IR1

3100

Ara+;Mtl-; Dext+;Kmr ; Tсs

IR2

3000

Asn+;Mal+; Suc-; Tсs

IR4

2900

Ala+;Mtl-; Dext+; Strr

Молоко

кобылье,

Башкирия


55

805


2500

Ala-;Mal+; Mtl-; Suc+; Rifr ;Strr

Штаммы лактококков,выделенные из молока московского региона,слабо или вовсе не сбраживали пентозы -ксилозу и арабинозу, а также маннит,которых всегда мало в молоке имолочнокислых продуктах (Riley et al., 2002). Ноштаммы К-205 из и IR-3, выделенные из курунги инапитка «Doоgh» (соответственно), являющиесяпродуктами смешанного молочнокислого испиртового брожения и вследствие этогоадаптированные к спиртовому субстрату,могли сбраживать сахароспирты, в том числеи маннит, что не характерно для L.lactis subsp. lactis, но являетсядифференцирующим признаком для L.lactis subsp. сremoris (табл.1).

Отличительнымпризнаком молочнокислых бактерий являетсявысокая потребность в сложных питательныхвеществах, пуринах, пиримидинах,аминокислотах, витаминах. Штамм 119отличался весьма ограниченнойпотребностью в ростовых компонентах, нопролин и урацил стимулировали егорост (табл.1).

Чувствительностьштаммов к антибиотикам является не толькофенотипическим признаком, но иобязательным, так как при использованиикультур, резистентных к лекарственнымпрепаратам, в пищевой и медицинскойпрактике, плазмиды, несущие генылекарственной устойчивости, могутпередаваться в макроорганизм и патогенныебактерий (Temmreman, 2003; Зигангирова и др., 2006). Порезультатам изучения чувствительностиизучаемых штаммов к антибиотикам быловыявлено, что штаммы чувствительны кантибиотикам, ингибирующим синтез белка:тетрациклину, доксициклину и левомицетину,в меньшей степени к аминогликозиднымантибиотикам - канамицину, сизомицину,неомицину и стрептомицину. Все штаммычувствительны к антибиотикам,ингибирующим синтез клеточной стенки.Чувствительность к пенициллину являетсявидовым признаком для лактококков. Ноштамм 194, выделенный из коровьего молока,устойчив к нему, что может бытьпоследствием применения этого препаратапри лечении коров.

Важным критерием отборабактериоцинобразующих штаммов являетсяспектр их антимикробного действия. Выделенные штаммы измолока г. Москвы и г. Клина подавляли росттолько грамположительных бактерий,включая спорообразующие бациллы B.subtilis, B.сoagulans, B.mycoides,микрококки M.luteus, M.flavum,S.aureus, что характерно длянизина A (препарат «Nisaplin») инизинпродуцирующего лактококка штамм МГУ(табл. 2).

Следует отметить, чтолактококки, выделенные из молока имолочных продуктов Бурятии и Ирана,отличались от штаммов Московской областивысоким уровнем антибиотическойактивности, обладали широким спектромантибактериального действия: эффективноподавляли рост как грамположительных, таки грамотрицательных бактерий: A.faecalis, P.vulgaris, E.coli, P.aeruginosa, атакже мицелиальных грибов: A.niger, P.chrysogenum, F.оxysporum, R.aurantiaca, C.guilliermondii. Ингибирование ростамикроскопических грибов, в том числе идрожжей, является неизвестнымбиологическим свойством для L.lactis subsp. lactis, и мы обнаружилиэто лишь у лактококков, выделенных измолока Бурятии и Ирана. Следовательно,имеет место и штаммовая специфичностьлактококков по синтезу бактериоцинов.Представленные данные можно рассматриватьне только как пример реакции биологическойсистемы на неблагоприятные факторывнешней среды, но и как системывзаимоотношений дрожжей и лактококков вприродных экосистемах.

Рис.2. Родственныевзаимоотношения штаммов лактококков,основанные на сходстве нуклеотидныхпоследовательностей гена 16S рРНК.

Таксономическоеположение выделенных культурклассическими микробиологическимиметодами идентификациибактериоцинобразующих штаммовлактококков было подтвержденогенотипическим методом, основанным наанализе сходства нуклеотидныхпоследовательностей гена 16S рРНК, какLactococcus lactis subsp.lactis. Уровеньгенетического родства всех изучаемыхштаммов по отношению к штаммам L. lactis subsp. cremoris составил всего 95,4– 96,6 %, хотя поряду физиолого-биохимических признаковштамм 119 был близок к лактококкам этогоподвида. Фингерпринты всех штаммовразличаются, что свидетельствует огенетических различиях между выделеннымиштаммами (рис. 2).

Таким образом,используя основной прием селекциимикроорганизмов, основанный наестественном отборе активных продуцентов,были выделены из природныхисточников новые оригинальные бактериоцинобразующие штаммыL. lactis subsp. lactis, проведенасравнительная оценка продуцентов и выборнаиболее перспективныхштаммов.

Разнообразие штаммов,имеющих различное географическоепроисхождение и обладающих сходнымифункциональными возможностями, являетсяследствием специфических условий, которыеформируются в экологической среде ихобитания. Полученные результаты вносятсущественный вклад в представление омеханизмах адаптации лактококков кстрессовым условиям среды обитания и ролиэтих микроорганизмов в эволюционныхпроцессах.

Слияние протопластовбактериоцинобразующих лактококков L. lactis subsp. lactis как методселекции.

В исследованиях, проведенных впоследние годы, выявлена принципиальнаявозможность получения суперпродуцентовбиологически активных веществ, в том числеи антибиотиков, а также штаммов сулучшенными технологическими свойствами врезультате использования метода слиянияпротопластов, позволяющего соединитьполные геномы и цитоплазмы родительскихштаммов с целью передачи им генетическойинформации. В отличие от генно-инженерныхметодов при слиянии протопластов вся ДНКможет подвергаться рекомбинации, и вслучае удачной рекомбинации можно ожидатьвозрастание «степени новизны» в полученииновых продуктов метаболизма. К основнымэтапам этого метода следует отнести:получение протопластов, собственнослияние, культивирование продуктовслияния в селективных условиях и процессрегенерации полученныхрекомбинантов.

Получениепротопластов.

Лактококки трудно перевести в формупротопластов общепринятым методом, т. е. спомощью лизоцима. Известно,что клеточная стенка низинпродуцирующихштаммов довольно толстая и в зависимостиот кислотности среды культивированиясоставляет от 31% до 42 % от сухой массыклетки. Причем, низинприсутствует в ней не в свободномсостоянии, а в виде Ca-низинового комплекса,и большая часть его связана с клеточнойстенкой (Hurst, 1981; Steen et al., 2003;Mainardi et al., 2005). В связи с этимнами разработана новая методика полученияпротопластов у бактериоцинобразующихлактококков, подобраны стабилизирующиебуферные системы, среды для регенерациипротопластов.

Для повышениячувствительности клеточной стенкилактококков к лизоциму использовалитиоловое соединение 2-меркаптоэтанол,сочетали действие лизоцима с -амилазой (табл. 3).Прединкубация лактококков вмеркаптоэтаноле предполагает, что агентдействует не на литический фермент, а наклеточную стенку, в какой-то мере разрыхляяее, чтопроявилось в снижении оптическойплотности бактериальной суспензии запериод инкубации в литической смеси.Количество протопластов у низкоактивныхштаммов 729 и 1605 составило 17,6 – 14,2%, у активныхпродуцентов (штаммов МГУ и 119) - 20,0 - 23,4%.2-меркаптоэтанол разрушает S - S связинизина, который локализован в клеточнойстенке лактококков и являетсяполипептидом с высоким содержаниемдисульфидных связей, разрываетдисульфидные связи в поверхностномбелковом слое клеточной стенки. При этомвысвобождаются различные ферменты,локализованные в районе клеточной стенки,в частности, кислая фосфатаза, чтооблегчает таким образом доступностьглюкановой матрицы для лизоцима.

Табл.2.Антимикробныйспектр действия штаммов лактококковразного происхождения.

Тест-культура

Ш т а м м ы

119

119х

729

229

194

К-205

IR3

IR4

МГУ

Низин,3000 МЕ/мл

Диаметр зон ингибирования роста,мм

Bacillusmycoides

20,0

16,0

10,0

16,0

19,5

16,0

11,0

24,0

13,0

17,0

Bacillussubtilis

12,0

18,0

10,0

15,0

22,0

20,0

11,0

24,0

16,0

18,0

Bacilluscoagulans

17,0

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |   ...   | 13 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»