WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 13 |

Для изученияплазмидного профиля родительских штаммови гибридных, полученных в результатеслияния протопластов, использовали известныйэлектрофоретический метод с выделениемплазмидной ДНК с помощью лизоцима,растворенного в 25 мМтрис-НСl (рН 8,0)с добавлением 0,25 МЭДТА и 30 мкл 20% SDS в 50 мМ трис-HCl (Румер, Лившиц,1992).

Экспериментальныеисследования по использованиюиндуцированного мутагенеза для повышения низинсинтезирующейспособности лактококков были проведеныизвестными методами по традиционнымпоказателям. В качестве объектов служилиприродный штамм L. lactis subsp. lаctis119, выделенный из простоквашиЭкспериментального завода ВНИМИ, штамм F-116,полученный в результате слиянияпротопластов, и их протопласты. Былииспользованы ультрафиолетовые лучи (УФЛ) ихимические мутагены: нитрозоэтилмочевина(НЭМ) и нитрозогуанидин (НГ).

При обработкехимическими мутагенами отмытые от средымолодые культуры экспоненциальной фазыроста и их протопласты ресуспендировали вцитратном буфере (рН 6,4) и обрабатывалираствором НЭМ (20 мг/мл) и НГ (500 мг/мл) в том жебуфере, инкубировали при 37°С. Пробыотбирали с разными экспозициями: для НГ - 10,30, 60, 90 минут, а для НЭМ - 30, 60, 90, 120, 150 минут.Для каждого опыта просчитывали по 120колоний. Полученные наиболее активныеварианты изучали по рядуфизиолого-биохимических свойств: динамикероста и синтезу низина, потреблениюуглеводов, чувствительности кантибиотикам.

В экспериментах поиспользованию отходов биотехнологичесихпроизводств для синтеза низина был отобранмутантный штамм №10, полученныйступенчатым воздействием УФЛ на природныйштамм 119. В работе использовали следующиесубстраты: картофельный сок,представляющий собой отход припереработке картофеля на крахмал послеотделения крахмала и мезги (Москворецкаяовощная база); пермеаты культуральныхжидкостей Bacillus subtilis и Aspergillus awamori —отходы при производстве амилолитическогофермента -амилазы и глюкоамилазы,образующиеся после концентрированияферментов на ультрафильтрационныхмембранах типа УАМ-150П, послеспиртоваябарда - отход производства этиловогоспирта после отгона последнего изсброженного спиртового сусла (Мичуринскийспиртзавод); а также фугат культуральнойжидкости Saccharomycescerevisiaе, являющийся отходомпри производстве хлебопекарных дрожжей(Московский дрожжевой завод); обезжиренноемолоко (обрат) и сыворотка - вторичное сырьепри производстве сливок и творога,получены спроизводственно-экспериментальногозавода ВНИМИ. К субстратам, представляющимпермеаты B.subtilisи A.awamori,добавляли глюкозу после стерилизации ввиде стерильного 20%-го раствора. Впослеспиртовую барду было добавленоосахаренное спиртовое сусло, чтобы общееколичество глюкозы в смеси составляло 0,5;1;2; 3; 4%. Исследования проводили натехнологическом стенде ВНИИПБ.

Изучен биохимическийсостав вышеуказанных субстратов.Количество редуцирующих сахаров в средахопределяли по методу Бертрана (Стоянова,1976); количество аминного азота определялиметодом формольного титрования (Плешков,1968), общего азота — по методу Несслера, фосфора — по методу Бриггса,аминокислотный состав анализировали спомощью ТСХ (тонкослойной хроматографии) сприменением пластинок «Silufol» (Иванова и др.,1986), сухих веществ — рефрактометрическим методом,содержание золы — по методике, изложенной вруководстве (Штыркова и др., 1986). В качествеконтроля использовали обезжиренноемолоко.

При оптимизации синтезановых бактериоциновперспективными штаммами L.lactis subsp. lаctis: природнымштаммом 194 и гибридным F-116, изучали влияниекомпонентов ферментационной среды.Эксперимент проводили по схеме методомизменения количества или исключениясоставных компонентов среды: уменьшениясодержания фосфатов в виде КН2РО4от 2,0 до 0,5%, увеличения содержания илизамена углеводного компонента, изменениясодержания дрожжевого автолизата,являющегося источником аминного азота,витаминов и нуклеиновых оснований.Динамику роста выделенных штаммов в средахоптимизированного состава изучали встационарных условиях в течение 24 часов. Вкачестве факторов, влияющих на продукциюбактериоцинов, исследовали 17 источниковуглеводов в среде в концентрации 1%, глюкозыи сахарозы в концентрации 2%. Методомдробного исключения одного или несколькихкомпонентов в среде культивированияустановлены отличительные признакиштаммов по усвоению ростовых компонентов.Значительное место в исследованияхзанимали вопросы о потребностяхлактококков в отдельных аминокислотах,добавляемых в среду культивирования вконцентрации 0,01%.

Влияние рН-статированияферментационной среды на синтезбактериоцина штаммами 194 и F-116 с проводили встационарных условиях при 30°С в колбах объемом 450мл и в ферментере фирмы LKB объемом 5 л савтоматической стабилизацией уровня рН10%-ным раствором NaOH на уровне 5,9 - 6,0.

Изучали диссоциациюштаммов L. lactissubsp. lаctis 194 игибридного F-116 на агаровой среде похарактеру диссоциативных изменений ихморфологии, а также антибиотическуюактивность диссоциантов к разнымтест-организмам на низин, левомицетин,нистатин. В качестве тест-культуриспользовали: для низина - B.coagulans, левомицетина -E.coli, длянистатина - A.niger.

Сравнивали способыхранения разных штаммов лактококков втечение длительного хранения (до 24 лет) по стабильности ихпроизводственно-важныхфизиолого-биохимических свойств:жизнеспособности клеток, бродильной иантибиотической активностей. Были использованы различныеспособы хранения - хранение подвазелиновым маслом, в обрате с частымипересевами и в лиофильном состоянии. Дляповышения устойчивости микроорганизмов кдегидратации при лиофилизациииспользовали разные криопротекторы: 10%сывороточный альбумин, 30% лошадиная сыворотка, 20%раствор сахарозы,комплексные защитные среды,содержащие (в %): 10 сахарозы + 5желатины; 1 желатины + 10сахарозы + 1 глютамата натрия +0,5 цитрата натрия. Изучали влияние состава защитнойсреды и способа подготовки бактериальнойсуспензии на антибиотическую активность ивыживаемость лиофилизированных культур(Стоянова, Аркадьева, 2000; Стоянова и др.,2004).

Токсикологическиеисследования новыхбактериоцинобразующих штаммов L. lactissubsp lactis:низинобразующего штамма 119х, гибридногоштамма F-116 и штаммов №№ 10, 25, 52, полученныхиндуцированным мутагенезом, проводили налабораторных животных (белых мышах иморских свинках) в соответствии сметодическими указаниями (11Государственная фармакопея, 1990; Хабриев,2005).

В работе по выделению иидентификации бактериоциноподобныхвеществ использовали штаммыL. lactis subsp. lactisразного происхождении. Для ихвыделения и очистки использовали вкачестве экстрагентов ряд такихрастворителей, как ацетон, гексан,н-бутанол, метанол и хлороформ в разныхконцентрациях (Стоянова и др., 2007).

Для обессоливанияэкстракта использовали картриджи:Диапак-SO3Н,Диапак-МПС-200, Диапак-С-16 (ЗАО «БиоХимМак,СТ», Москва). Десорбцию проводилиацетонитрилом и трифторуксусной кислотойв различных концентрациях. Дляпрепаративного извлечения бактериоциновиз культуральной жидкости использовалисмесь ацетон —уксусная кислота — вода в соотношении 4:1:5.Концентрирование фильтратовпроводили на роторном испарителе (UP-1-M3) при+55 - +60°С, 74 об/мин.

Колоночнуюхроматографию проводили на носителе Kieselgel60 фирмы «Merck» (ФРГ). Анализ полученныхфракций проводили методом ТСХ в системеметанол:вода (96:4) в сочетании сбиоавтографией на тест-организмы B.coagulans 429 и B.subtilis АТСС 6633. Спектрыснимали на спектрофотометре Shimadzu UV-160 1PC(Japan). Масс-спектры выделенных антибиотиковрегистрировали на приборе VISION методом MALDI -TOF в режиме положительных ионов наматрице — DHB(2,5-дигидрокси-бензойная кислота). Анализсвойств бактериоцинов проводили помощьюкомпьютерной базы данных BNPD (Вerdy, Hungary).

Для подтверждениябелковой природысинтезируемых новых антибиотическихкомплексов были проведены исследования повлиянию специфического ингибитора синтезабелка левомицетина (100 мкг/мл) на ростпродуцентов, синтез белка и синтезбактериоцинов. Белок определяли по методуЛоури (Lowry еt al., 1951). Термостабильностьбактериоцинов определяли, прогреваяэкстракты при 55оС в течение 90, 120, 150 мин, при 100оС в течение 5, 15 и 30мин, затем охлаждая и тестируя наантагонистическую активность.

pH-стабильностьбактериоцинов определяли, инкубируяэкстракты в интервале pH от 2-х до 10 в течение4 ч, затем разводя в буфере с pH 7 и определяябактерицидную и фунгициднуюактивность.

Методом лиофильнойсушки наработана опытнаяпартиябактериоцина ЛГС. Параметрысушки: температура замораживания - 40оС, температурасублимации - 30оС, максимальная температурапродукта - 60оС.Сравнивали бактериоцин ЛГС с коммерческимпрепаратом «Nisaplin» фирмы «Aplin & Barrett, LTD» по уровнюантибиотической активности и спектруантимикробного действия.

Экспериментальныеисследования по апробации бактериоцинаЛГС и гибридного штамма L.lactis subsp. lactisF-116 дляхранения охлажденного мяса и рыбыпроводили на технологическом стенде ВНИХИ.Сравнивали их эффективность скоммерческим препаратом низина, лизоцимомв концентрации 0,25 %, препаратом ППС-10(полимерный пленкообразующий состав).Образцы обрабатывали вышеуказаннымиконсервантами посредством распыления наповерхность, упаковывали в пленку подвакуумом и хранили в условиях бытовогохолодильника при 4°С. Были проведенымикробиологические исследования образцоврыбы через 5, 10, 15 суток хранения, а мяса - втечение 85 суток с интервалом 7, 10, 20 дней(ГОСТ Р 51448-99). Изучалисанитарно-бактериологическое состояниеобразцов на наличие патогенныхмикроорганизмов, включая бактерии группыкишечной палочки (БГКП), Salmonella gallinarum, Listeria monocytogenеs, в соответствии с ГОСТ 10444.13-94 иСанПиН 2.3.2.1078-01, определяли присутствиеряда бактерий, способных развиваться притемпературе, близкой к 5°C, в условияхповышенной влажности: Pseudomonasaeruginosa, Proteus vulgaris, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus, Enterococcus sp.,споровые аэробные ианаэробные формы, включая бактерии из рода Clostridium, Bacillus cereus, атакже дрожжи и плесени.

Изучали возможностьиспользования гибридного штамма L. lactis subsp. lactis F-116 дляобессахаривания яичного белка, как предварительного этапа егообработки перед высушиванием, с цельюувеличения срока хранения сухого белка.Использовали яичный белок куриных яицптицефабрики ВНИИПП. Для ускоренияпроцесса ферментации в жидкий яичный белоквносили дрожжевой автолизат в количестве 35мг% по аминному азоту. По окончаниипроцесса обессахаривания яичный белокподвергался высушиванию тепловойраспылительной сушкой наполупроизводственной установке«Ниро-Атомайзер» (Дания). Температура взоне сушки - 55-60оС. Количество глюкозы определялиферментным методом с глюкозооксидазой(Лукомская, Городецкий, 1961; Стоянова и др.,1982). Контроль качества продуктаосуществляли по ГОСТ 30 3642-96.

Проводили экспериментыпо использованию культуральной жидкостиштамма L. lactis subsp. lactis 194, обладающегофунгицидной активностью, для храненияобразцов колбасных изделий: сервелатсырокопченый «Зернистый» ТУ 9213038-510-323-26-03,колбаса сырокопченая «Свиная» ГОСТ 16131-86.

Проведенаидентификация грибной плесени с поверхности зараженных колбас сиспользованием классическихмикологических методов и современныхопределителей: по типу колоний, цвету,характеру роста, а также по типу конидий,плодового тела, структуре аскоспор (Raper,Fennel, 1965; Hoog еt al., 2000, Klich, 2002).

Образцы колбасныхизделий, обсемененные плесневым грибом,были продезинфицированы 70%-ным спиртовымраствором до полного очищения от гриба, азатем опытные образцы были обработаныкультуральной жидкостью с антибиотическойактивностью 4000 МЕ/мл, рН 4,2. Контрольные (безобработки) и опытные образцы вышеуказанныхколбасных изделий были заложены нахранение при температуре 10оС на 2 месяца.

Статистическуюобработку результатов всехисследований проводили с использованиемкомпьютерных программ Excel 200 (Microsoft Inc., 1999),Statistica for Windows, v. 5.0 (StatSoft Inc., 1995), рассчитываясреднюю арифметическую, доверительныеинтервалы, стандартное отклонение.Достоверность различий между среднимивеличинами оценивали с использованиемt-критерия Стьюдента (Р<0,05).

РЕЗУЛЬТАТЫИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Выделение природныхактивных бактериоцинобразующих штаммовмезофильных лактококков и ихидентификация.

Национальныекисломолочные продукты смешанногомолочнокислого и спиртового брожений,распространенные среди народов Азии,Башкирии, Ирана и других стран помимовкусовой и питательной ценности обладаютрядом свойств, обуславливающих ихприменение в лечебно-профилактическихцелях. Одним из определяющих свойствявляется их высокая ингибиторнаяактивность по отношению патогенным иусловно-патогенным микроорганизмам. Примикроскопировании курунги из Бурятии и«Doogh» из Ирана в поле зрения видны дрожжи имолочнокислые бактерий, представленныепалочками и кокками, единичными исобранными в цепочки разной длины. Вкумысе, полученном из Башкирии,приготовленном на производственнойкумысной закваске, лактококки не былиобнаружены. Микробиота кумыса из Башкириисостояла из молочнокислых бактерий Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus и дрожжей Torula lactis(рис.1).

1 2

3 4

Рис.1. Микробиотакурунги (1,2); иранского напитка “Doogh”(3)

(электронныйсканирующий микроскоп, увеличение 1 х 4000) икумыса (4)

(в световом микроскопе,1х 900).

Нами разработан методвыделения и дифференциациибактериоцинобразующих штаммовмезофильных лактококков из вышеуказанныхпродуктов. Из курунги было выделено 36бактериоцинобразующих штаммов сактивностью, рассчитанной по низину, от 450до 2700 МЕ/мл, отобран штамм К-205 с активностью2700 МЕ/мл. Из иранского продукта «Doogh» быловыделено 25 штаммов мезофильныхкислотообразующих молочнокислых бактерий,4 штамма из их числа обладали высокойбактериоцинпродуцирующей активностью,отобран штамм IR3 с активностью 3400 МЕ/мл(табл.1).

Всего из молока имолочных продуктов разных территориальныхзон выделено более 500 штаммов мезофильныхбактериоцинобразующих лактококков.Наиболее перспективные были изучены иидентифицированы до подвида Lactococcus lactis subsp. lactis.

Первоначальнаяидентификация включает комплексфенотипических признаков, основанных наизучении морфологических ифизиолого-биохимических свойствлактококкков (Хоулт и др., 1997; Ленгелер и др.,2005). По морфологии и культуральнымсвойствам все выделенные бактерии близки кмолочнокислым мезофильным бактериям родаLactococcus. Наплотных агаровых средах с гидролизатоммолока или синтетической с фосфатом идрожжевым автолизатом колонии быликруглые блестящие с ровными краямидиаметром от 1,5 мм до 3,0 мм. При глубинноминкубировании лактококки образовываликолонии лодочкообразной формы.

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 13 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»