WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 13 |

Соискателю принадлежитопределяющая роль в выборе направленияисследований, постановке цели и задач дляее выполнения, разработке схем проведенияэкспериментов на всех этапах исследований,анализе и обобщении результатов. В работах,выполненных в соавторстве, соискательлично принимала участие в экспериментах,интерпретации полученных результатов,подготовке научных публикаций, выступала сдокладами на конференциях и международныхсимпозиумах.

Апробациярезультатов.

  1. Результатыдиссертационной работы были представленыи доложены на различных конференциях имеждународных конгрессах. Сделано 45докладов, в том числе на: ХVI World’s Poultry Science Congress, Brasilia,I978; VI съезде Всесоюзногомикробиологического общества, Рига, 1980;Всесоюзной конференции «Созданиехимико-фармацевтических препаратовбиотехнологическими методами», Москва, 1985;VП съездe ВМО «Достижения микробиологии -практике», Алма-Ата, 1983; конференции«МГУ-Главмикробиопрому», 1985; Всесоюзныхконференциях: «Биосинтез ферментовмикроорганизмами», Кобулети, 1986;«Биосинтез вторичных метаболитов», Пущино1987; «Разработка и применение антибиотиковнемедицинского происхождения», Москва, 1987;«Микроорганизмы - ингибиторы и стимуляторыроста животных и растений», Ташкент, 1989; SecondInternational Symposium on Overproduction of microbial products.Сzechoslovakia, 1988; I-st International Symposium of Chiral Molecules, Paris,France, 1988; International Conference “Biotechnology and Food», Stuttgart,1989; The Forth and Fifth Symposium of Lactic Аcid Bacteria, The Netherlands,I993, 1996; The 2-nd Workship оn Lantibiotics, The Netherlands, 1994;Международной конференции «Прикладнаябиотехнология на пороге ХХI века», Москва,1995; Международная научно-техническаяконференция «Пища. Экология. Человек»,Москва, 1995; XIX-ом Международном симпозиумеICFMH – FOOD MICRO,Slovenia, 2004; Всероссийском симпозиуме смеждународным участием «Биотехнологиямикробов», М., 2004; Всероссийском симпозиумес международным участием “Автотрофныемикроорганизмы” памяти академика РАН Е. Н.Кондратьевой, М., 2005; 10-ой Пущинской школе -конференции молодых ученых «Генетикамикроорганизмов и биотехнология»,посвящённая 100-летию со дня рождения С. И.Алиханяна, 2006, Москва–Пущино; Научно-практическойконференции «Интеграция фундаментальныхисследований –основа развития современныхаграрно-пищевых технологий». Углич. 2007; TheInternational scientific and practical conference Biotechology. Water and foodstuffs. Moscow. 2008.

Публикации.

По материалудиссертации опубликовано 100 печатныхработ, в том числе 6 обзоров и разделы в 2-хмонографиях, 34 статьи, 45 тезисов, 5авторских свидетельств, заявка на патент, 6нормативных документов.

Соискатель награждена 3медалями ВДНХ «За достигнутые успехи вразвитии народного хозяйства СССР»:

Структура и объемдиссертации.

Диссертация состоит извведения, обзора литературы (глава I) изаключения по литературному обзору,экспериментальной части, которая включаетматериалы и методы (глава II), результаты иих обсуждения (глава III), заключения,выводов, списка литературы (430наименований, из них 279 иностранныепубликации) и 10 приложений, которыевключают: методику определениянуклеотидных последовательностей генов 16SрРНК; заключения о результатах определенияпатогенных свойств штаммов лактококков:акты опытно-промышленных испытаний,лабораторные регламенты на синтезбактериоцинов Lactococcus lactissubsp. lactis штаммами F-116 и 194.

Работа изложена на 356страницах машинописного текста (безприложений), включает 98 таблиц и 63 рисунка;выполнена на кафедре микробиологиибиологического факультета МГУ им.М.В.Ломоносова. Некоторые исследованияпроводили в ГУ НИИНА (Государственномучреждении научно-исследовательскоминституте по изысканию новых антибиоиковим. Г.Ф. Гаузе РАМН), ФГУП НИИгенетика(Федеральном государственном унитарномпредприятии научно-исследовательскоминституте генетики промышленныхмикроорганизмов), Государственных научныхучреждениях (ГНУ) Россельхозакадемии:ВНИМИ (Всероссийскомнаучно-исследовательском институтемолочной промышленности), ВНИИПБ(Всероссийском научно-исследовательскоминституте Пищевой биотехнологии), ВНИИПП(Всероссийский научно-исследовательскийинститут птицеперерабатывающейпромышленности), ВНИХИ (Всероссийскийнаучно-исследовательский институтхолодильной промышленности).

СОДЕРЖАНИЕРАБОТЫ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.(глава I) включает 5 разделов,содержащие описание: характеристикилактококков (раздел 1), современноесостояние вопроса по свойствам, структуре,классификации, биосинтезу и механизмудействия бактериоцинов (раздел 2), селекциипродуцентов бактериоцинов, включаяиспользование естественногоотбора ценных форм, искусственного отбора методом клеточной инженерии (слияние протопластов) ииндуцированного мутагенеза (раздел 3),хранения продуцентов (раздел 4), применения молочнокислых бактерий иих бактериоцинов в качестве биологическихконсервантов (раздел 5) изаключение.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯЧАСТЬ

Объекты и методыисследования

В работе использовалисырое коровье молоко без консервантовмолочных комбинатов г. Москвы, Клина(Московская область), г. Улан-Удэ (Бурятии),Ирана, кобылье молоко из Башкирии инациональные кисломолочные напитки:курунга из Бурятии, кумыс из Башкирии и«Doogh» из Ирана.

Выделениебактериоцинобразующих лактококковпроводили поэтапно.

Для выделениямезофильных лактококков из курунги, кумысаи «Dough» 5 % испытуемого материала высевали вжидкую среду МРС (HiМedia, India), используемуюдля культивирования молочнокислыхбактерий и параллельно делали высев насреду Сабуро для выращивания дрожжей,содержащую (г/л): глюкоза — 40,0; пептон — 10,0; агар — 18,0;левомицетин —0,001 (Стоянова и др., 2006).

Мезофильные лактококкивыращивали на агаровых средах в течение 3 - 4суток и отделяли от других молочнокислыхбактерий по виду колоний на чашке Петри ипри микроскопировании препаратов. Длявыделения активных низинобразующихштаммов L. lactissubsp. lactis спомощью стерильного репликатора проводиливысев кислотообразующих колоний споверхности агаровой среды,приготовленной на основе гидролизатамолока с индикатором, на газон стест-культурой Bacilluscoagulans 429 и параллельновысевали на твердую среду вышеуказанногосостава без тест-культуры. Отбирали клоны,образующие наибольшую зону задержкироста.

Для микроскопическихисследований морфологии молочнокислыхбактерий, выросших в молоке или молочныхпродуктах, готовили фиксированныепрепараты. Фиксированный препаратрекомендуется окрашивать метиленовымсиним в течение 2–3-х мин, поскольку именно этоткраситель слабо окрашивает основной фонпрепарата (казеин молока) и хорошопрокрашивает клетки, что обеспечиваетчеткость препарата (Стоянова, 2005).

Морфологию изучаемыхштаммов и микробиотыкурунги, кумыса и иранского напитка «Doogh»изучали традиционнымиметодами с помощью микроскопа МБИ-15 сфазово-контрастным конденсором КФ-4, атакже проводили их электронно-микроскопическоеисследование с помощью сканирующегоэлектронного микроскопа “CanScan”фирмы«Gresham» (Англия). Препараты фиксировали 5%-нымраствором глутарового альдегида вацетат-вероналовом буфере в течение 1 ч,обезвоживали спиртом увеличивающейсяконцентрации (10° — 100°) с экспозицией 30 мин при каждойконцентрации и выдерживали в амилацетате втечение 1 ч (Герхард, 1984; Стоянова, Егоров,1988).

Идентификацию бактерийпроводили, руководствуясь перечнемкультуральных и физиолого-биохимическихпризнаков (Хоул и др., 1997; Степаненко, 2006).Физиолого-биохимические свойства наиболее активных побактериоцинобразующей активностивыделенных штаммов лактококков оценивалипо потреблению углеводов, потребности вфакторах роста, уровню их ингибиторнойактивности, спектру действия. При изученииферментативной активности был использованряд углеводов, включающий сахара,сахароспирты, полисахариды. Потребностьвыделенных штаммов в факторах ростаизучали по влиянию 20-ти аминокислот, 5витаминов, пуриновых и пиримидиновыхоснований, способных включаться вметаболизм лактококков. Методом дробногоисключения определяли один или группуфакторов, необходимых для роста (Герхард,1984; Стоянова, Егоров, 1999). Количествомолочной кислоты определяли методомтитрования, а качественную реакцию намолочную кислоту проводили по реакции«серебряного зеркала» (Инихов, Брио, 1971;Стоянова, 2005).

Бактериоцинсинтезирующуюактивность молочнокислых бактерийопределяли методом диффузии в агар сизмерением зоны подавления ростатест-культуры Bacilluscoagulans 429 в мм. В качествестандарта на грамположительные бактериииспользовали коммерческий препарат низина«Nisaplin» (фирма“Aplin & Barrett, Ltd”, Великобритания) сактивностью 1х106 МЕ/г; на грамотрицательныебактерии —левомицетин, с активностью 100 мкг/мл (ЗАО«Биофарм Право-Альфа», Россия); на грибы идрожжи —нистатин (ОАО «Биосинтез» с активностью100000 ед./г). Для титрования бактериоцинаиспользовали суспензию 17-часовой культурыбактерий, которыми засевали среду,приготовленную на фосфатном буфере с рН 5,5(Стоянова и др., 1996).

При изучении спектраингибирующего действия штаммовлактококков в качестве тест-культуриспользовали 5 штаммов грамположительныхбактерий: Micrococcus luteus 128, M flavus 45, Bacillus mycoides 32, B.subtilis2, B.coagulans 429, Staphylococcus aureus 144; 5штаммов грамотрицательных бактерий: Alcaligenes faecalis 82, Escherichia coli 52; Pseudomonas aeruginosa 21, P.fluorescens 19, Proteus vulgaris 206; а также пять штаммовмикроскопических грибов, включая дрожжи:Aspergillus niger 369,Penicillium chrysogenum 32, Fusarium oxysporum 9, Candida guilliermondii 217, Rhodotorula aurantiaca 226 (Стоянова, Аркадьева, 2000). Штаммыбыли получены из коллекциимикроорганизмов кафедры микробиологиибиологического факультета МГУ им. М. В.Ломоносова

Чувствительность кантибиотикам определяли методом диффузиив агар с использованием дисков. Был испытанряд антибиотиков, ингибирующих синтезбелка: тетрациклин, левомицетин, сизомицин,стрептомицин, доксициклин, олеандомицин,неомицин, ампициллин, канамицин,рифампицин; и синтез клеточной стенки:бензилпенициллин, карбенициллин,метициллин, ристомицин, цефалексин,цефалотин, низин (Галкина, 1984, Егоров,2005).

Таксономическоеположение выделенных штаммов лактококковподтверждали методом генотипирования,основанном на анализе сходствануклеотидных последовательностей гена 16SрРНК (Cusick, O’Sullivan, 2000; Суходолец и др., 2005).Секвенирование очищенных фрагментов генов16S рРНК проводили по методу Сэнгера (Sаnger etal., 1977), используя автоматическийсеквенатор Beckman Coulter. При построениифилогенетического дерева использовалипоследовательности близких пофизиолого-биохимическим свойствамреферентных штаммов: Lactococcuslactis subsp.lactis AB100798, AB118034, AJ419572, L. lactis subsp. lactis bv. diacetylactis AY920468, AY920469,L. lactis subsp.cremoris AB100792, AB100802,полученные из базы данных NCBI.Секвенирование проводили в ФГУП НИИгенетика.

Для проведенияселекционной работы по использованиюметода слияния протопластов лактококки инкубировали до раннейстадии экспоненциального роста,обеспечивающей достаточный урожай молодыхактивно растущих клеток. Клетки отделялицентрифугированием при 1380 gв течение 20 мин, отмывали отсреды культивирования стабилизирующимбуфером, обрабатывали лизоцимом,растворенным в стабилизирующем буфере вконцентрации 1 - 2 мг/л и выдерживали при 37°Св течение 0 — 60мин. В некоторых вариантах опыта дляусиления действия лизицима клетки передобработкой лизоцимом выдерживали в буферес добавлением 0,01% 2-меркаптоэтанола (фирма«Ferak», Германия) в течение 10 — 30 мин, сочеталидействие лизоцима с -амилазой животного происхождения(фирма «Reanal», Венгрия), ЭДТА(этилен-диамин-тетраацетат-натрия, фирма«Reanal»), как рекомендовано рядомисследователей (Gabor, Hotchkiss, 1979; Стоянова идр., 1987; 1990; Белясова и др., 2002).

Изучали влияниеаминокислот, способных включаться в синтезпептидогликана клеточной стенкилактококков по типу аналога D-аланина, нарост культур и процесс протопластирования(Стоянова и др., 1987; Nouaille et al., 2004). Былииспользованы глицин, лизин, глутаминоваякислота и DL-треонин в концентрации от 0,1% до1,0 %, которые добавляли в ферментационнуюсреду (Стоянова и др., 1988).

В качествестабилизаторов были опробованы семьбуферных систем, приготовленных на основетрис-НС1-буфера с добавлением 3 мМ MgCl2 и 0,6 М сахарозы (рН 8,0);0,9 М КС1 и 0,02 М MgSО4 (рН 7,5); 0,9 M KC1 и 0,25 М ЭДТА (рН 7,6); наоснове TES-буфера с добавлением 5 мМСаCl2 и 0,5 Мсахарозы (рН 7,2); углеводные: с 0,6 М глюкозы,растворенной в трис-НС1-буфере, с 0,8 Мглюкозы в буфере, приготовленном на основе0,5 М лимонно-кислого трехзамещенногонатрия, 1 М аммония хлористого и 0,05 М ЭДТА(рН 6,4).

Способностьпротопластов регенерировать клеточнуюстенку изучали при параллельном высеве нагипертоническую среду соответствующихразведений суспензии протопластов,отмытых от лизирующей смеси, встабилизирующем буфере и воде.Гипертонической регенерационной средойслужила двухслойная агаровая среда,приготовленная на основе ферментационнойс добавлением в качестве стабилизаторовреагентов: 0,6 М глюкозы: 0,5 M сахарозы; 0,05 Mглицина и 0,5 M СаС12; 0,5 M СаС12; 0,9 M MgSO4,0,6 M KCl. Верхний мягкий слой ее содержал 0,8%агар-агара, а нижний - 2,0%.Протопласты, полученные нарегенерационной среде, высевали в обрат,культивировали при обычных для L. lactis subsp lactis условиях, изучалиих морфологические, культуральные ифизиолого-биохимические свойства.Параллельно проводили высев протопластовиз лизирующей смеси в обрат, изучаливозможность развития протопластоподобныхL-форм в среде с микродозамилизоцима.

Для слиянияпротопластов устанавливалимаркированность отобранных штаммов поряду фенотипических признаков:потребность в углеводах, ростовыхкомпонентах и чувствительности кантибиотикам, что послужило основой длясоставления селективных сред при отбореполученных рекомбинантов.

Жизнеспособныепротопласты лактококков, отмытые отлизоцима и ресуспендированные встабилизирующем аммонийно-цитратномбуфере, смешивали перекрестно в том жебуфере с добавлением ПЭГ - 6000(полиэтиленгликоль, фирма «Reanal», Венгрия) ивышеуказанных стабилизаторов,инкубировали при 37°С в течение 20—40 мин. В качествеселективных сред для отбора рекомбинантовслужила агаровая ферментационная среда с 1%глюкозы (полноценная среда для гибридов иродительских штаммов), среды с 1% сахарозы,фузидином и низином (100 мкг/мл). Изучалисегрегацию клонов по ихнизинсинтезирующей активности на разныхсредах. Полученные гибридные штаммыоценивали по скорости роста,ферментативной активности в отношениисбраживания углеводов, накоплениябактериоцинов, спектру антимикробнойактивности.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 13 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»