WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 13 |

Стоянова ЛидияГригорьевна

«Новые бактериоцинылактококков и их практическоеиспользовагние»

03.00.07 и 03.00.23

биологическиенауки

Д501.00.21

Московскийгосударственный университет им. М. В.Ломоносова.

119992, Москва,Ленинские горы, МГУ

Тел..939-54-83

Email: anetrusov& mail.ru

Предполагаемая защитадиссертации - 17 июня 2008

АВТОРЕФЕРАТ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙУНИВЕРСИТЕТ

им. М. В.ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правахрукописи

СТОЯНОВАЛИДИЯ ГРИГОРЬЕВНА

НОВЫЕ БАКТЕРИОЦИНЫЛАКТОКОККОВ И ИХ ПРАКТИЧЕСКОЕИСПОЛЬЗОВАНИЕ

Специальности03.00.07 –микробиология

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации насоискание ученой степени

доктора биологическихнаук

Москва -2008.

Работа выполнена на кафедремикробиологии биологического факультетаМосковского государственногоуниверситета имени М. В. Ломоносова.

Научныйконсультант:

доктор биологическихнаук, профессор Александр Иванович Нетрусов

Официальныеоппоненты:

докторбиологических наук, профессор НинаБорисовна Градова

доктор биологическихнаук, профессор Лариса ПетровнаБлинкова

доктор технических наукНина Васильевна Нефедова

Ведущее учреждение:Институт биохимии ифизиологии растений и микроорганизмов РАН(г.Саратов).

Защита диссертациисостоится «17» июня 2008 г. в 15 ч 30 мин на заседании диссертационногосовета Д 501.001.21 при Московскомгосударственном университете им. М. В.Ломоносова по адресу: 119992, Москва,Ленинские горы, МГУ, д. 1, корп. 12,биологический факультет, аудитория М1.

С диссертацией можноознакомиться в библиотеке биологическогофакультета МГУ им. М. В. Ломоносова.

Авторефератразослан «»мая 2008г.

Ученый секретарьдиссертационного совета,

кандидат биологическихнаукН. Ф. Пискункова

Общая характеристикаработы

Актуальностьпроблемы.

Антимикробный эффектмолочнокислыхбактерий человечество использовало в тойили иной форме в течение столетий дляпродления срока годности пищевыхпродуктов за счет образования молочнойкислоты с сопутствующим понижением рН, атакже биологически активных веществ,обладающих бактерицидным действием наспецифические группы микроорганизмов,включая и патогенные формы. Ведущее место вобъяснении явления антагонизмамолочнокислых бактерий отводитсяспецифическим антибиотическим веществамбелковой природы – бактериоцинам. Бактериоцины – это гетерогенныеантибактериальные комплексы,разнообразные по уровню активности,спектру и механизму действия, молекулярноймассе, физико-химическим свойствам, ноосновной биологически активной частьювсех бактериоцинов являетсябелковый компонент (Блинкова и др.,1984; 2004;Егоров и др.,1999; Nes et al., 2007). Считают, чтобактериоциногения – явление, закономерное практическидля всех видов бактерий. Говоря обэкологическом значении бактериоцинов,необходимо отметить, что синтез этихвеществ выполняет главную роль вконкуренции внутри популяции.

Интереск использованию бактериоцинов,образуемыхлактококками, резко возрос. Одним изглавных аспектов этого интереса являетсявозросший спрос потребителей к качествупродуктов питания и ихбезопасности для здоровья,поскольку широко используемыехимическиеконсерванты инекоторые антибиотики, увеличивающиесрок храненияпродуктов питания,вызывают опасения. Наиболее изученным иразрешенным для применения в качествебиологического консерванта являетсябактериоцин низин, единственный изантибиотиков с 1998 года имеющий «GRAS» (GenerallyRecognized As Safe) cтатус, т.е. признанный Европейскимпарламентом как безопасный. Экспертныйкомитет по пищевым добавкам FAO/WHO (Пищевая иСельскохозяйственная Организация ООН /Всемирная Организация Здравоохранения)рекомендовал использование низина вкачестве консерванта для пищевыхпродуктов (код Е234). Низин не являетсячужеродным веществом для пищеварительноготракта человека, посколькунизинобразующие лактококки выделяют изслизистой носоглотки, а также калаживотных и людей. Установлено, чтонизинобразующие штаммы имеют функциюподдержания экологического равновесиягруппы молочнокислых бактерий кишечноготракта. Являясь низкомолекулярным белком,низин легко переваривается, не оказываявлияния на микробиоту желудочно-кишечноготракта, не токсичен (Ross et al., 1999; Nete et al., 2006). Описанынесколько форм низинов (A, B, C, D, E, Z, R, Q) иродственных им лактицинов, отличающихсямежду собой по ряду физико-химическихсвойств, аминокислотному составу и спектруантибактериального действия, продуцентамикоторых являются разные штаммы одногоподвида Lactococcus lactis subsp. lactis.Однако активность описанных природныхпродуцентов низкая (от 579 до 1886 МЕ/мл) иантимикробный спектр действия низинараспространяется, в основном, награмположительные бактерии (Franz et al., 1997; Buyonget al.; 1998, Janes, 1999; Lee and Paik, 2001; Zendo et al., 2003; Yildirim etal., 2004; Porgtharaqkui and Demirci, 2006).

Синтез бактериоцинов -наследственная особенностьмикроорганизмов, проявляющаяся в том, чтокаждый штамм способен образовывать одинили несколько определенных, строгоспецифичных для него антибиотическихвеществ. В большинстве популяциилактококков синтез бактериоцинов можноиндуцировать генно-инженерными методами,различными физико-химическимивоздействиями: ультрафиолетовыми лучами,мутагенами химической природы,ДНК-тропными веществами, перекисями идругими агентами. Разработка методовселекции продуцентов низина началась еще в70-ые годы ХХ-го века, но, к сожалению, былаприостановлена. Вследствие этого внастоящее время имеются немногочисленныеданные по этому вопросу.

Сегодня известны дваосновных производителя низина. Фирма «Aplin& Barrett, Ltd» (Beaminster, Dorset, UK) производитпродукт «Низаплин», а «Chr. Hansen A/S» (Hoersholm, DK)выпускает «Кризин». Препараты обеихкомпаний имеют очень схожиехарактеристики, содержат 2,5% активногокомпонента, который переводится наантимикробную активность как 1х106 МЕ/г. Получают ихпутем ферментации с помощью селекционногоштамма Lactococcus lactis subsp. lactis(Breukink, de Kruijff, 1999).

В настоящее время учёныемногих лабораторий мира изучают пути испособы направленного синтезабактериоцинов для создания биологическимпутем различных модификаций уже известныхбактериоцинов, но с более ценнымисвойствами или же пытаются получить новыеприродные сбалансированныебактериоциногенные комплексы, безопасныедля использования в качествебиоконсервантов. Возможностьконструирования новых антимикробныханалогов (бактериоцинов) в перспективеможет оказаться главным методом борьбы сантибиотикоустойчивыми патогеннымибактериями. Особый научный интереспредставляют молочнокислые стрептококкисерологической группы N, которые посистематическому положению недавновыделены из группы микроорганизмов родаStreptococcus,включающего патогенные формы, и под новымназванием Lactococcus отнесены к категории «GRAS», кудаотнесены микроорганизмы, не вызывающиеинфекционных заболеваний человека иживотных. Поэтому лактококки, как и ихбактериоцины, могут быть использованы вкачестве природных биологическихконсервантов.

Завышенное потреблениетеплоэнергоресурсов и потери продукции до30% при транспортировке, переработке ихранении являются актуальными проблемамиАгропромышленного комплекса РФ.Экономический эффект от использованиянизина в консервной промышленности велик и обусловленсокращением продолжительности стерилизации продуктов иувеличением сроков их реализации: на 15-25 %снижаются теплоэнергозатраты, сохраняютсябиологическая и пищевая ценность продуктапитания, продлеваются сроки хранения(Кудряшов и др., 1995). Созданиетехнологии производствабактериоцинов в России позволитотказаться от закупки дорогостоящихпрепаратов, а использованиевысокоактивного продуцента определитрентабельноть производства бактериоцинов.

Цель и задачиисследования.

Цельисследований состояла вполучении новых высокоэффективныхбактериоцинов, образуемых лактококкамиLactococcus lactissubsp. lactis, дляпрактического использования в качествебиологических консервантов.

Для выполненияпоставленной цели были поставленыследующие задачи:

скринингприродныхбактериоцинобразующих штаммовлактококков изестественной среды обитания молочнокислыхбактерий, какой является коровье и кобыльемолоко, кисломолочные продуктылечебно-профилактического назначенияразных территориальных зон, идентификацияперспективных штаммов;

получение активныхпродуцентов бактериоцинов сиспользованием методов клеточнойинженерии (протопластирования, слиянияпротопластов) и индуцированногомутагенеза;

на основевысокопродуктивных бактериоцинобразующихштаммов оптимизировать процесс синтезабактериоцинов;

разработать методывыделения, очистки и идентификации новыхбактериоцинов;

показать возможностьпрактического использованиябактериоцинобразующих лактококков и ихбактериоцинов в качестве биологическихконсервантов.

Научная новизнаработы.

Впервые проведенскрининг бактериоцинобразующих штаммовмезофильных лактококков излечебно-профилактических национальныхпродуктов смешанного молочнокислого испиртового брожений курунги (Бурятия), Doogh(Иран), также из коровьего и кобыльегомолока разных территориальных зон.Выделены новые высокоактивныебактериоцинобразующие природные штаммы:из свежего коровьего молока Московскойобласти - штамм 119х с низинсинтезирующейактивностью 3700 МЕ/мл (а.с. № I55I744), из Бурятии -штамм 194 с активностью 3600 МЕ/мл широкого спектрабактерицидного и фунгицидного действия,что является неизвестным свойством длялактококков этого вида. Выделенные штаммыидентифицированы как Lactococcuslactis subsp.lactis.

Разработана новаяметодика получения протопластов убактериоцинобразующих лактококков,подобраны стабилизирующие буферныесистемы для регенерации протопластов,изучено влияние протопластирования нафизиолого-биохимические свойствалактококков, в том числе и на синтезбактериоцинов. Установлено, чтопротопластирование, реверсия протопластовк клеточной форме и слияние протопластовлактококков могут служить методамиселекции активных форм. Полученыпродуценты, в 10 – 14 раз превышающие активностьродительских штаммов (а.с. № 1687616,серебряная медаль ВДНХ).

Оптимизирован синтезбактериоцинов компонентным составом средыза счет снижения содержания фосфата,замены углеводного компонента, внесенияаминокислот и рН-статирования.

Разработана схемавыделения и очистки новых бактериоцинов,синтезируемых перспективными штаммамиL. lactis subsp. lactis разногопроисхождения. Получены и изучены ихиндивидуальные компоненты вхроматографически чистом виде.Установлено, что бактериоцины,синтезируемые гибридным штаммом F-116 иоригинальным природным штаммом 194, не имеютаналогов в компьютерной базе данныхприродных биологически-активных веществBNPD (“Bioactive Natural Product Database”, Вerdy, Hungary).

Практическаязначимость работы.

Выделены иидентифицированы новые природныеперспективные бактериоцинобразующиештаммы мезофильных лактококков Lactococcus lactis. subsp. lactis, пополнившиеколлекцию лактококков – активныхпродуцентов низина и новых бактериоцинов,обладающих уникальным для бактерий этоговида фунгицидным действием. Нуклеотидныепоследовательности генов 16S рРНК природныхновых бактериоцинобразующих штаммовдепонированы в базу данных GenBank.

Использование вкачестве ферментационных субстратов дляполучения бактериоциновотходов рядабиотехнологических производствпредставляет реальную возможность решенияпроблемы защиты окружающей среды приодновременном удешевлениитехнологического процесса.

Изучена диссоциацияпродуцентов, что облегчает отбор активныхвариантов при использовании штаммов впромышленном производствебактериоцинов.

Разработана технологияполучения нового препарата ЛГС,синтезируемого гибридным штаммом F-116,обладающего широким спектромантимикробного действия, включаяпатогенные и условно-патогенные формы,развивающиеся в продуктах питания прихранении, что позволяет рекомендовать егов качестве биологического консерванта (Актопытно-промышленных испытаний от19.09.2007г.).

Разработанылабораторные регламенты на процесссинтеза бактериоциновприродным штаммом L. lactis subsp. lactis 194 какбиологического консерванта фунгицидногодействия для производства сырокопченныхколбас (Акт испытаний от 16.06. 2006 г.).

Результаты исследованийвошли в учебники для студентов вузов,подготовленные в соавторстве ссотрудниками кафедры микробиологиибиологического факультета МГУим.М.В.Ломоносова. Разработаны курсы лекцийи практических занятий для подготовкиспециалистов в Биотехнологическом центреМГУ: «Актуальные проблемы микробиологии»,«Бактериоцины молочнокислых бактерий» идр.

Работа с 1985 года былаподдержана постановлениями Совмина СССР,ГКНТ, Правительства Москвы, МеждународнойПравительственной программой между СССР иИндией, межвузовской программой«Биотехнология в российских вузах»,грантами РФФИ 98-04-49822 и 01-04-48661 «Управлениепроцессами биосинтеза биологическиактивных веществ микроорганизмами», ФЦАТПN 60123.01.02 по фундаментальным и поисковымисследованиям и разработкам МинпромнаукиРоссии «Исследования и разработки поприоритетным направлениям развития наукии техники на 2002-2004 годы»; блок 2«Проектно-прикладные исследования».

Положения, выносимые назащиту.

Выделение иидентификация новыхбактериоцинобразующих штаммов Lactococcus lactis из молока,молочных продуктов и национальныхкисломолочных напитковлечебно-профилактического назначенияразных территориальных зон.

Селекция активныхбактериоцинобразующих штаммов с помощьюметода клеточной инженерии (слиянияпротопластов) и индуцированногомутагенеза (с использованиемультрафиолетовых лучей и супермутагеновхимической природы).

Оптимизация синтезабактериоцинов компонентным составомферментационной среды и стабилизацией рН впроцессе ферментации. Использование вкачестве ферментационных субстратов дляполучения низина отходов рядабиохимических производств.

Разработка способавыделения эффективных бактериоцинов изкультуральной жидкости, идентификацияновых антибиотических комплексов.

Практическоеиспользование перспективныхбактериоцинобразующих штаммов Lactococcus lactis subsp. lactis и их бактериоциновв качестве биологическихконсервантов.

Личный вкладсоискателя.

Pages:     || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 13 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»