WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |

Метаболизм гриба при росте in vivo значительно отличается от культивирования в лабораторных условиях. Поэтому нами были проведено изучение адгезии на питательных средах различного состава. Для исследования влияние состава среды на адгезивные свойства штаммов были взяты среды: Ричарда, Крабиля, желточная среда, среда с галактозой, Сабуро, Сабуро в отсутствии глюкозы и модифицированная нами среда Сабуро с добавлением небольшого количества (4 г) тиогликолевой среды. Каждая среда содержала в составе свой, отличный от других, источник питательных веществ (например, крахмал, минеральные соли, белок, сахара, лецитин и другие питательные компоненты). Изучение культуры гриба на адгезивные свойства проводили после наступления равномерного роста. Причем продолжительность лаг-фазы зависела от качества среды. Так на среде Ричарда (минеральная среда) лаг-фаза продолжалась четверо суток, а на среде Сабуро без добавления глюкозы двое с половиной суток. Установление лаг-фазы производили методом отбора проб. Наибольший процент адгезии отмечался у штаммов, культивируемых на средах с углеводами (Крабиля, среда с галактозой, Сабуро и модифицированная среда Сабуро). Самый высокий процент адгезии наблюдался у штаммов, культивируемых на среде с галактозой и модифицированной среде Сабуро до 44% у патогенного штамма и 2.5% у непатогенного штамма № 4. Самый низкий процент адгезии отмечался у штаммов, выращенных на среде Ричарда: 8.1% у патогенного штамма и 0.02% у непатогенного штамма. В результате проведенных экспериментов установили, что состав питательной среды не только определяет особенности метаболизма клеток гриба как описано в литературе, но и значительно изменяет скорость образования и характер адгезинов штаммов. Для дальнейшей работы использовалась модифицированная среда Сабуро, где за основу взята среда Сабуро, общепризнанно являющаяся оптимальной для культивирования грибов, с добавлением тиогликолевого компонента, что делает ее более богатой, стимулируя проявление широкого спектра адгезинов.

Рисунок 6. Влияние количества проведенных пассажей на адгезивные свойства штаммов (n=5; p<0.95)

Опытным путем доказано, что адгезивные свойства штаммов С.albicans меняются при проведении более двух пассажей на искусственной среде. Так, непатогенный штамм №4 терял свою способность к адгезии после третьего пассажа, а патогенный штамм №228 проявлял свою активность, хотя и в меньшей степени, после четвертого пассажа. Видимо, это связано с тем, что клеткам гриба, растущим на богатой среде, для жизнедеятельности достаточно питательных веществ, и образование большого количества адгезинов становится ненужным.

Таким образом, подобраны оптимальные условия для проведения процесса адгезии 48 часовой культуры С.albicans на гемоглобин, иммобилизованный на поверхности нитроцеллюлозной пленки. Время инкубации пленки составило 2 часа, а температура инкубации – 300 С.

2. Тестирование модели адгезии клиническими штаммами C.albicans, выделенными из различных мест локализации.

Для подтверждения адекватности разработанной модели адгезивные свойства штаммов C. albicans из различных мест локализации (ротовая полость и кожный покров) дополнительно изучали на различных белках, эти данные представлены в таблице 3.

Полученные данные показывают, что, независимо от места локализации, наилучшая адгезия у всех штаммов наблюдалась на пленке с иммобилизованным гемоглобином, что значительно выше, чем для ЧСА, БСА, Ig А, коллагена. Таким образом, модель с иммобилизованным гемоглобином наилучшим образом отображает адгезивные свойства штаммов. Установлено, что штаммы, выделенные с кожных покровов, значительно (почти в 2-3 раза) уступали в адгезии штаммам, выделенным из ротовой полости. Таким образом, подтверждается предположение, что штаммы различной локализации обладают отличиями в адгезивных свойствах.

Таблица 3.

Уровень адгезии штаммов гриба к различным белкам при их поверхностной иммобилизации (n=5; p<0.95)

Штаммы

Человеческий сывороточный альбумин

Бычий сывороточный альбумин

Гемоглобин

IgА

Коллаген

Адгезия клинически

значимых штаммов ротовой полости, % (N=12)

Адгезия клинически незначимых штаммов ротовой полости, % (N=7)

Адгезия клинически значимых штаммов кожных покровов, % (N=14)

Адгезия клинически незначимых штаммов кожных покровов, % (N=5)

21.0+0.1

7.0+0.3

12.1+0.2

3.1+0.4

26.2+0.6

7.9+0.2

13.4+0.4

2.9+0.7

39.7+0.8

16.2+0.2

16.1+0.4

4.8+0.6

18.5+0.5

6.4+0.2

10.3+0.5

2.4+0.4

28.2+0.4

6.9+0.3

14.4+0.6

3.9+0.7

Тестирование адгезивных свойств клинически значимых штаммов грибов показало, значительное (почти в 3 раза) увеличение уровня адгезии, по сравнению с клинически незначимыми штаммами. Из полученных данных видно, что наблюдаются статистически достоверные отличия у штаммов. Следует отметить, что разработанная модель достоверно отражает отличие адгезивных свойств штаммов грибов, являющихся возбудителями кандидоза, и штаммов, выделенных от лиц без клинического проявления кандидоза (кандиданосительство).

3. Изучение влияния трипсина и маннопротеидного антигена на адгезию клеток.

Известно, что в процессе адгезии клеток гриба участвуют различные компоненты клеточной стенки гриба, причем основными медиаторами адгезии являются белки и маннопротеины клеточной стенки, тогда как другие компоненты клеточных стенок, такие как хитин, -глюкан и липиды принимают незначительное участие в способности гриба к адгезии [Сергеев с соавт., 2001].

Нами было изучено влияние трипсина и маннопротеидного антигена на белковые и маннопротеидные компоненты клеточной стенки C. albicans, для определения характера взаимодействия клетки гриба с предлагаемой моделью. Существующие сведения о полном ингибировании процесса адгезии протеолитическими ферментами не нашли своего подтверждения в нашем исследовании. После обработки клеток гриба трипсином процент адгезии снизился, по сравнению с контролем, в два раза, но полностью адгезивных свойств клетки гриба не лишились (рисунок 7).

Рисунок 7. Влияние трипсина и маннопротеидного антигена на уровень адгезии клеток С. albicans (n=5; p<0.95)

Нанесение на пленку с иммобилизованным гемоглобином маннопротеидного антигена способствовало блокированию маннопротеидных компонентов клеточной стенки С. albicans -предполагаемых механизмов связывания клеток гриба с белковыми молекулами гемоглобина. Наблюдаемое снижение адгезии в два раза свидетельствует о значительной роли маннопротеинов в адгезии клеток гриба в данной системе.

Проведенные исследования продемонстрировали, что адгезия клетки гриба на пленку с иммобилизованным гемоглобином в значительной степени связана с белками и маннопротеинами клеточной стенки. Однако сохранение некоторой доли адгезивных способностей в процессе исследования, свидетельствует о наличии иных механизмов адгезии, возможно, связанных с гидрофобными свойствами поверхности клеточной стенки гриба.

Таким образом, адгезия гриба в данной модели протекает при участии разнообразных механизмов связывания клеточной стенки, что наиболее полно отражает возможности клетки в проявлении адгезивной способности.

4. Использование модели на основе нитроцеллюлозной пленки с иммобилизованным гемоглобином для изучения адгезивных свойств штаммов Candida albicans при кандидозах различной локализации.

Для изучения адгезивных свойств, все штаммы были разделены с учетом места обнаружения на три группы: 1) штаммы со слизистых оболочек ротовой полости, 2) штаммы со слизистых оболочек влагалища и 3) выделенные с поверхности гладкой кожи туловища и конечностей.

Кандидоз кожи обычно рассматривается как состояние, развивающееся вторично под действием общих факторов. Основным в патогенезе является нарушение барьерной функции кожи. Кроме этого лечение антибиотиками провоцирует рост популяции C. albicans делающее возможным последующую колонизацию кожи.

Выделено 90 штаммов C. albicans от больных в возрасте от 10 до 54 лет с клинически подтвержденным диагнозом с яркой картиной поражении кожного покрова с высокой и низкой степенью обсемененности. Причем, у многих больных в возрасте от 32 до 54 лет встречались хронические формы кандидоза (ХКК) и микоза кожи (ХМК).

У штаммов C. albicans, выделенных от больных с диагнозом микоз и кандидоз кожи во всех группах прослеживается устойчивая закономерность в адгезивных способностях (таблица 4). Так, при высокой степени обсемененности в посевах уровень адгезии в 90% случаях был высоким или умеренно высоким, а при низкой степени обсемененности в 80% случаях низкий уровень адгезии.

Таблица 4.

Адгезивные свойства штаммов, выделенных с кожных покровов больных с клинически подтвержденным диагнозом микоз и кандидоз кожи различных возрастных групп (n=5; p<0.95)

Уровень обсемененности грибов С.albicans

Возрастные группы больных

Общее количество штаммов

Количество штаммов при различном уровне

адгезии

<5%

5-12%

12-20%

КОЕ>103 ед/мл

от 10 до 17 лет

от 17 до 32 лет

от 32 до 54 лет

15

15

15

1

2

2

4

4

7

10

8

6

КОЕ<102 ед/мл

от 10 до 17 лет

от 17 до 32 лет

от 32 до 54 лет

15

15

15

12

9

10

3

5

5

0

1

0

Таким образом, адгезивные способности штаммов, выделенных с поверхности кожи при кандидозах, коррелируют с клиническими проявленииями заболевания и уровнем обсемененности грибами C. albicans.

Однако, проведенное исследование адгезивных свойств штаммов С. albicans выделенных от больных с диагнозом «атопический дерматит» (АД) (130 штаммов) показало, что, в зависимости от возраста пациента, взаимосвязь обсемененности с уровнем адгезии проявляется различным образом (табл. 5). Так, для детей до 2 лет часто даже при очень высокой обсемененности (КОЕ>105 ед/мл) штаммы характеризовались невысоким уровнем адгезии (<5%), тогда как для возрастных групп от 12-17 и 17-30 лет наибольшее число штаммов с низким уровнем адгезии соответствовало низкой степени обсемененности анатомической точки, а штаммам с высоким уровнем адгезии соответствовало высокая степень обсемененности.

Полученные результаты (уровень адгезии <5%) указывают, что у детей младшего возраста, и в некоторых случаях старшей группы больных АД, дрожжевая инфекция, по-видимому, чаще всего протекает в форме неинвазивного процесса и является следствием основного заболевания. Однако в старшей группе больных часто выделялись штаммы с высоким уровнем адгезии, что указывает на более выраженные патогенные свойства штамма и его возможно более активную роль в инфекционном процессе. Такие проявления адгезивной способности штаммов свидетельствуют об патогенетических особенностях заболевания АД.

Таблица 5.

Адгезивные свойства штаммов, выделенных с кожных покровов больных с диагнозом «атопический дерматит» различных возрастных групп (n=5; p<0.95)

Уровень обсемененности грибов С.albicans

Возрастные группы больных

Общее количество штаммов

Количество штаммов при различном уровне

адгезии

<5%

5-12%

12-20%

КОЕ>104 ед/мл

дети до 2-х лет

от 3 до 12 лет

от 12 до 17 лет

от 17 до 30 лет

18

25

20

17

12

6

3

2

4

13

7

4

2

6

10

11

КОЕ<102 ед/мл

дети до 2-х лет

от 3 до 12 лет

от 12 до 17 лет

от 17 до 30 лет

6

15

12

17

4

9

8

11

1

4

3

4

1

2

1

2

Сопоставление, полученных результатов для штаммов, выделенных при АД и микозах кожи, требует учета патогенетических особенностей этих заболеваний. Поскольку в случае АД при имеющихся повреждениях кожного покрова симптомы кандидоза могут быть обусловлены менее агрессивными штаммами, тогда как при развитии ХКК инвазивный процесс связан со штаммами с высоким адгезивным потенциалом.

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»