WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |

2 вариант: 0.05 г белка разводили в 5 мл фосфатного буферного раствора с рН 7. Нитроцеллюлозную пленку помещали в растворенный белок и инкубировали 2 часа при температуре 200С. Пленку высушивали при комнатной температуре на фильтровальной бумаге [Медянцева с соавт., 1999].

Приготовление суспензии клеток C. albicans.

Исследования проводились на дрожжевых клетках C. albicans. После выделения гриба в чистую культуру готовили их суспензию. Для этого штаммы гриба выращивали в пробирках на скошенной среде Сабуро, в течение 48 часов при температуре 300С. Для получения суспензии из колонии микробиологической петлей осторожно снимали слой клеток, при этом петля должна легко скользить во избежание повреждения клеточных стенок. Затем клетки грибов суспендировали в 3 мл фосфатного буферного раствора с рH 5.

Определение количества адгезировавшихся клеток

После приготовления пленки приступали непосредственно к определению уровня адгезии. Вначале измеряли оптическую плотность приготовленной суспензии клеток при длине волны 540 нм. Раствором сравнения служил фосфатный буфер. После измерения оптической плотности в пробирку с 3 мл суспензии клеток помещали нитроцеллюлозную пленку площадью 7 см2 и инкубировали 2 часа при температуре 300С. Затем, встряхнув несколько раз пробирку, для получения однородной взвеси клеток, снова измеряли оптическую плотность суспензии клеток при длине волны 540 нм. Количество адгезировавшихся клеток на нитроцеллюлозную пленку определяли по разнице начальной и конечной оптической плотности суспензии клеток и подсчетом клеток адгезировавшихся на поверхности пленки не менее 10 полей при помощи микроскопа Микмед-6 увеличение 10х20.

Влияние трипсина и маннопротеидного антигена клеточной стенки С. albicans на адгезию клеток C. albicans.

Влияния трипсина и маннопротеидного антигена клеточной стенки С. albicans проводили методом острого опыта [Дудка с соавт., 1982].

В 5 мл раствора трипсина (0.025 г трипсина растворяли в 5 мл дистиллированной воды) суспендировали клетки С. albicans и инкубировали 1 час при температуре 300С. Затем биомассу отделяли от трипсина на центрифуге в течение 10 минут, при 3000 g. Клетки гриба дважды отмывали от раствора трипсина 2-кратным объемом дистиллированной воды. Клетки грибов суспендировали в 3 мл фосфатного буферного раствора с рH 5. После этого проводили определение адгезивных свойств как описано выше.

Для изучения влияния маннопротеидного антигена клеточной стенки С. albicans на процесс адгезии к 1.5 мл раствора антигена (0.5 мг антигена растворяли в дистиллированной воде) добавляли 3.5 мл фосфатного буферного раствора с pH 5, куда затем помещали нитроцеллюлозную пленку с иммобилизованным белком. Инкубировали 1 час при температуре 300С. Определение адгезии проводили, как описано выше.

Определение содержания количества антигена клетками C. albicans.

Получение антигенов

Для получения антигена C. albicans использовали методику получения антигенов по ВФС 42-93-88 [Глушко с соавт., 1986], разработанную в лаборатории по разработке грибковых аллергенов Казанского НИИ эпидемиологии и микробиологии.

В колбы с жидкой питательной средой (200 мл), где присутствует экзогенный белок (БСА), как единственный источник азота, засевали штаммы C. albicans. Процесс выращивания проходил при рН 5.5, в течение 6 суток, температура культивирования +300С. По окончании культивирования измерялась оптическая плотность при длине волны 540 нм. Чистоту культуры контролировали микроскопированием нативных препаратов. Затем питательную среду вместе с культурой клеток центрифугировали (3000gх10мин) в течение 10 минут. Осадок, состоящий из клеток C. albicans высушивали и взвешивали. Затем клетки гриба помещали в стерильную ступку и растирали стерильным песком. После измельчения клеток в ступку добавили 5 мл стерильной дистилированной воды, полученную кашицу перенесли в центрифужные пробирки и центрифугировали (3000gх10мин) в течение 10 мин. В надосадочной жидкости измеряли количество антигена содержащегося в клетках гриба. Расчет количества антигена производили по отношению к оптической плотности культуры. Все измерения велись по отношению к культуральной жидкости.

Количество антигена грибов C. albicans, выделенного в среду во время роста грибов определяли следующим способом. Надосадочную жидкость состоящую из питательной среды после центрифугирования осаждали тремя объемами охлажденного спирта высшей очистки в течение суток при температуре +40С с дальнейшим центрифугированием (3000gх10мин) в течение 10 мин. Осадок высушивали и разводили 5 мл стерильной дистиллированной воды, затем определяли количество антигена. Опыты проводили в трех биологических повторностях.

Определение концентрации антигена С. albicans

Определение количества антигена (Аг) проводили с помощью амперометрического иммуноферментного сенсора [Медянцева с соавт., 1999], в состав биочувствительной части которого входят антитела к антигену С.albicans и фермент бутирилхолинэстераза. Измеряли высоту катодного пика при потенциале -0.55 В, относящегося к процессу обратимого восстановления меркаптида ртути, образующегося в результате взаимодействия продукта спонтанного гидролиза тиола с материалом электрода (ртутью).

Высота тока пика зависит от концентрации продукта ферментативного гидролиза БТХИ, а отношение тока эксперимента к току контрольного (холостого) опыта пропорционально логарифму концентрации антигена. Строили градуировочную зависимость, которую использовали для определения неизвестной концентрации антигена.

Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку результатов исследований осуществляли с использованием компьютерных программ «Microsoft Excel» и «Statistic for Windows». При обработке результатов исследования вычисляли значение средней величины и стандартную ошибку средней. Достоверность различий между группами оценивали с использованием t-критерия Стьюдента. Разброс показателей, отображенный в графиках, представлен с доверительным интервалом для р<0,05. Исследование взаимосвязи между отдельными показателями проводили с применением корреляционного анализа.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Разработка модели адгезии C.albicans на нитроцеллюлозной пленке.

Первым этапом исследований явилось создание модели для определения свойств адгезии in vitro, которая бы позволила адекватно изучить адгезивную способность штамма.

Первоначально было изучено взаимодействие клеток C.albicans с нитроцеллюлозной пленкой. Изучение связывания клеток гриба на нитроцеллюлозную пленку, приготовленную с добавлением глутарового альдегида в отсутствие белков в реакционной смеси, показало, что начальная оптическая плотность суспензии клеток после инкубации пленки практически не изменялась, отклонения были незначительны и составляли менее 0,03%. Микроскопические исследования показали наличие на пленке одиночных дрожжевых клеток.

Таким образом, показано, что сама нитроцеллюлозная пленка не обладает способностью связывать клетки гриба. Взаимодействие клеток с поверхностью пленки незначительно и носит неспецифический характер. Поэтому в дальнейших опытах на нитроцеллюлозной пленке с иммобилизованными белками неспецифическое связывание не учитывали.

Для изучения специфического связывания использовались белки макроорганизма: человеческий сывороточный альбумин, бычий сывороточный альбумин, иммуноглобулин А, гемоглобин и коллаген.

При специфическом связывании всех изучаемых белков при совместной иммобилизации их с глутаровым альдегидом внутри пленки, после инкубации на поверхности пленки адгезировались около 10% клеток патогенного штамма и около 0,2% клеток непатогенного штамма. Можно предположить, что клетки C.albicans не могут проникнуть внутрь пленки, а количество белка на поверхности недостаточно для адгезии клеток гриба.

В связи с этим, в последующих экспериментах использовали нитроцеллюлозную пленку с поверхностно иммобилизованными белками. Изучена адгезия клеток гриба к различным белкам (табл. 2), для оценки эффективности связывания и выбора наилучшего субстрата адгезии.

Полученные данные показывают, что поверхностное нанесение белков, позволяет добиться существенного увеличения адгезии клеток на нитроцеллюлозную пленку. По-видимому, поверхностная иммобилизация белка с помощью глутарового альдегида делает его более доступным для связывания с адгезинами C. albicans. Установлено, что максимальная адгезия (59.4%) наблюдалась на пленке с иммобилизованным гемоглобином, что значительно превышает соответствующие значения, полученные для ЧСА, БСА, иммуноглобулина А, коллагена. Полученные данные согласуются с данными литературы о способности гемоглобина усиливать процесс адгезии гриба [Chaffin et al.,1998, Dostal et al.,2003], раскрывая все адгезивные способности клетки гриба.

Поэтому для дальнейших исследований адгезии клеток мы использовали нитроцеллюлозную пленку с иммобилизованным гемоглобином, так как он, являясь основным компонентом клеток крови – эритроцитов, вполне доступен и сравнительно недорог.

Таблица 2.

Адгезия клеток гриба при различной иммобилизации белков (n=5; p<0.95)

Субстрат адгезии

Количество адгезированных клеток патогенного штамма, %

Количество адгезированных клеток непатогенного штамма, %

Нитроцеллюлозная пленка

Белок при совместной иммобилизации

Белок, иммобилизованный на поверхность пленки:

  • Человеческий сывороточный альбумин
  • Бычий сывороточный альбумин
  • Гемоглобин
  • Иммуноглобулин А
  • Коллаген

0.03+0.1

10+0.1

28.0+0.4

33.9+0.8

59.9+0.7

23.4+0.8

35.7+0.3

0.01+0.1

0.2+0.1

0.5+0.2

0.7+0.5

1.4+0.4

0.5+0.2

0.7+0.4

Вместе с этим осуществлялся подбор оптимальных условий для проведения процесса адгезии (рисунки 1-6). Изучено влияние возраста штамма на адгезию клеток, влияние на адгезию температуры инкубации пленок, времени инкубации, влияние состава среды инкубации и среды культивирования на процесс адгезии. При наблюдении 1-4 суточных культуры штаммов №4 и №228 установлено, что наибольший процент адгезировавшихся клеток у обоих штаммов приходится на 48-часовую культуру, хотя патогенный штамм №228 проявлял свою активность, как в первые, так и на третьи сутки. Отмечено, что C.albicans достигает начала стационарной фазы в течение 48 часов, при этом все биохимические процессы достигают своего пика. Однако, после двух суток роста, культура, особенно малоактивная, начинает стареть.

Рисунок 1. Влияние возраста штамма на адгезию клеток (n=5; p<0,95)

Так же выявлена зависимость интенсивности адгезии от температуры. Самые высокие значения адгезии получены у патогенного штамма №228 при 370С. Однако для дальнейших исследований выбрана температура 300С, которая является оптимальной для всех видов штаммов (патогенных и непатогенных), а адгезия в этом случае идет также эффективно и составляет до 80% от максимальных значений.

Рисунок 2. Влияние температуры инкубации на эффективность адгезии клеток (n=5; p<0,95)

Увеличение времени инкубации приводит к увеличению процента адгезированных клеток. Однако после 2 часов инкубации при микроскопических исследованиях наблюдалось деление клеток и образование трубок прорастания. То есть процент адгезировавшихся клеток увеличивался за счет образования новых клеток принявших активное участие в процессе адгезии. В связи с этим для анализа первоначальной культуры инкубацию необходимо проводить не позднее двух часов. Такой период инкубации позволяет разработать методику экспресс-определения адгезивных свойств штамма на основе предлагаемой модели.

Рисунок 3. Влияние времени инкубации на адгезию клеток

(n=5; p<0,95)

Рисунок 4. Влияние рН среды на процесс адгезии (n=5; p<0.95)

При подборе рН среды для инкубации, клетки суспендировали в буферном растворе с рН от 2 до 9 и инкубировали в течение двух часов. Исследование при более кислом рН не имеет смысла, так как происходит свертывание белков. Установлено, что наибольший процент адгезии отмечался при рН 2-5. Однако, слишком низкий рН среды нехарактерен для человеческого организма. Также учитывая, что максимальная протеолитическая активность выявлена при слабо кислом рН среды [Klotz et al.,1991] и она является наиболее благоприятной для жизнедеятельности гриба C.albicans, использовался буферный раствор с рН 5-5.5.

Важным фактором для проведения процесса адгезии является состав среды при инкубации суспензии клеток в присутствии нитроцеллюлозной пленки с иммобилизованным гемоглобином. Использование питательных сред, в качестве инкубационной среды, уменьшало адгезивные свойства грибов в 4-5 раз по сравнению с фосфатным буфером и физиологическим раствором. По-видимому, высокое содержание питательных веществ, в средах, дает грибу возможность, к активному питанию не прибегая к процессу адгезии. Применение фосфатного буфера стабилизирует биохимические процессы клеточной стенки гриба. В связи с этим, использование фосфатного буфера для проведения процесса адгезии наиболее целесообразно.

Рисунок 5. Влияние состава среды инкубации на процесс адгезии (n=5; p<0,95)

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»