WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 | 5 |

На правах рукописи

ЛИСОВСКАЯ Светлана Анатольевна

НОВЫЙ ПОДХОД К ОЦЕНКЕ ПАТОГЕННОГО ПОТЕНЦИАЛА КЛИНИЧЕСКИХ ШТАММОВ CANDIDA ALBICANS

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Казань – 2008

Работа выполнена в лаборатории микологии ФГУН Казанского научно исследовательского института эпидемиологии и микробиологии Роспотребнадзора.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Фассахов Рустем Салахович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, зав. каф. микробиологии КГМА. О.К. Поздеев,

доктор биологических наук, профессор, профессор кафедры микробиологии КГУ Т.В. Багаева

Ведущая организация:

Федеральное государственное учреждение науки Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени академика И. Н. Блохиной Роспотребнадзора

Защита диссертации состоится «13» ноября 2008 г. в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 212.081.08 при Казанском государственном университете по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, д. 18, главное здание, ауд. 211.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Н. И. Лобачевского при Казанском государственном университете.

Автореферат разослан « » 2008 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук З. И.  Абрамова

Актуальность проблемы. В последнее время неуклонно увеличивается заболеваемость кандидозом, при этом наиболее частым возбудителем остается Candida albicans [Елинов, 2007, Chaffin et al.,1998]. Показано наличие штаммов, обладающих выраженными дерматонекротическими, адгезивными и гемолитическими свойствами, и отличающихся по ряду биологических свойств от штаммов, выделенных от здоровых лиц. В то же время даже среди штаммов-комменсалов могут встречаться штаммы, способные, под воздействием определенных экзогенных или эндогенных факторов, вызывать широкий спектр поражений.

На практике потенциальную патогенность принято характеризовать наличием и проявлением факторов патогенности, основанных на физиологических особенностях грибковой клетки и характере ее взаимодействия с макроорганизмом, которые способствуют закреплению гриба в организме и развитию заболевания [Дьяков с соавт., 2005]. Многие современные тесты (начиная с «феномена ростовых трубочек», определения активности ферментов и, наконец, ПЦР), лишь идентифицируют C. albicans. Наиболее распространенным лабораторным критерием тяжести течения кандидоза является определение величины титров маннанового антигена клеточной стенки C. albicans, проявляющего выраженную сенсибилизирующую активность [Сергеев с соавт., 2001, Глушко с соавт., 2002]. Однако, на сегодняшний день не выработано четких лабораторных критериев, позволяющих однозначно охарактеризовать патогенность штамма и разграничить кандидоз и кандиданосительство. Экспериментальное заражение животных для определения патогенности C. albicans в практических лабораториях не используется.

В связи с этим важным дополнением к установлению патогенности штамма является изучение взаимосвязи основных факторов патогенности грибов (адгезии, уровня антигенов) у различных клинических штаммов C. albicans с целью выяснения их соотношения при различных проявлениях кандидоза. В этом плане использование комплексного подхода может способствовать разработке единого лабораторного теста для определения уровня патогенности штамма C. albicans.

Известно, что любой инфекционный процесс начинается с адгезии возбудителя на клетках-мишенях. Все C. albicans обладают выраженной способностью прикрепляться к органическим и неорганическим субстратам. В настоящее время стало возможным измерять степень адгезии. Установлена четкая корреляция между способностью гриба к адгезии и его вирулентностью в эксперименте [Сергеев с соавт., 2001].

Таким образом, поскольку адгезия гриба к клеткам и тканям макроорганизма является первоначальной ступенью инвазии грибковых клеток и одним из основных факторов патогенности, приводящей к развитию кандидоза, было бы чрезвычайно интересно изучить адгезивные свойства клинических штаммов с целью выяснения их связи с особенностями проявления заболевания.

В этом плане представляет интерес разработка легко воспроизводимого метода определения адгезивной активности штаммов. Существующие в настоящее время модели адгезии из-за разнообразия условий существования штаммов, приводящей к выборочной экспрессии различных механизмов адгезии не являются абсолютно адекватными и удобными для исследования большого количества штаммов [Сергеев с соавт., 2001].

Цель и задачи исследования. Целью представляемой работы является изучение основных факторов патогенности (адгезии и уровня антигенов) у различных клинических штаммов C. albicans in vitro с целью выяснения их соотношения при различных проявлениях кандидоза. Достижение поставленной цели связывалась с решением следующих задач:

1. Разработать новую модель для определения адгезивных свойств дрожжеподобных грибов.

2. Исследовать адгезивные свойства штаммов, выделенных от больных с различными формами кандидозов.

3. Изучить и сопоставить основные факторы патогенности (адгезии и уровня антигенов) с учетом конкретной локализации грибов.

4. Оценить влияние грибов-ассоциантов на степень проявления адгезивных свойств гриба.

Научная новизна работы. Разработана модель адгезии клеток C. albicans на нитроцеллюлозную пленку с иммобилизованным гемоглобином, которая адекватно отражает уровень адгезии штаммов и позволяет в полной мере раскрыть их адгезивные свойства. Используемая пленка имеет постоянные свойства, что позволяет проводить исследование большого количества штаммов в идентичных условиях, тем самым, делая возможной стандартизацию предлагаемого метода определения адгезивных свойств.

Впервые проведено сопоставление двух основных факторов патогенности (адгезии и уровня антигенов) грибов C.albicans in vitro на различных клинических штаммах, включая и музейный штамм. Исследования показали отличия в биологических и биохимических свойствах штаммов, в том числе, в зависимости от их мест локализации в макроорганизме. Выявлена корреляция между различными характеристиками вирулентных свойств гриба. Штаммы с высоким процентом адгезии содержали большое количество антигена в клетках.

Изучено влияние условий культивирования штаммов на проявление факторов патогенности. Подобраны оптимальные условия (состав среды культивирования, температура, рН среды инкубации и т.д.) для проведения эксперимента in vitro, наиболее приближенные к жизнедеятельности грибов в макроорганизме. Показано изменение процесса адгезии под влиянием экстракта из грибов, которые наиболее часто обнаруживаются в ассоциациях с C. albicans.

Практическая ценность работы. Предложена модель для определения уровня адгезии штаммов дрожжеподобных грибов, которая может быть применима в практикующих лабораториях. Эту модель характеризуют постоянные свойства носителя, что позволяет определять адгезивные свойства большого количества штаммов в идентичных условиях, тем самым, делая возможной стандартизацию метода.

Использование предлагаемой модели помогает быстро дифференцировать патогенные и непатогенные штаммы по проявляемому ими уровню адгезии к белкам (в частности, гемоглобину).

Использование комплексного подхода к изучению патогенных свойств штамма (адгезивной способности и антигенных свойств), позволит систематизировать штаммы по их способности быстро колонизировать, инфицировать, и «избегать» защитные механизмы макроорганизма.

Результаты исследования могут быть использованы как один из критериев диагностики кандидоза и прогнозирования микотических осложнений у больных с иммунодефицитами.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработана эффективная модель in vitro для определения адгезивных свойств дрожжеподобных грибов, где в качестве субстрата адгезии предложен гемоглобин.

2. У музейных и клинических штаммов C. albicans выделенных от больных с различными формами кандидоза выявлены значительные различия в адгезивных свойствах.

3. Адгезия и антигенная активность клинических штаммов C. albicans коррелирует между собой.

4. Разработан и рекомендуется к применению новый способ оценки патогенного потенциала клинических штаммов C. albicans.

Апробация работы.

Результаты работы докладывались и обсуждались на научно-практической конференции «Актуальные проблемы дерматовенерологии. ХХI век» (Казань, 2003), Научно-практической конференции по медицинской микологии (VIII Кашкинские чтения, С.-Петербург, 2005г.), IX Всероссийском Съезде дерматовенерологов (Москва, 2005г.), IV Всероссийском конгрессе по медицинской микологии (Москва, 2006г.), IX Кашкинских чтениях (С.-Петербург, 2006г.), V Всероссийском конгрессе по медицинской микологии (Москва, 2007г.), X Кашкинских чтениях (С.-Петербург, 2007г.), XVII Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Казань, 2007г.), II Съезде микологов России (Москва, 2008г.).

Публикации: По теме диссертации опубликовано 17 работ. Из них 4 статьи и 13 тезисов докладов на всероссийских конференциях.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 129 страницах машинописного текста, содержит 12 таблиц и 21 рисунков. Работа состоит из введения, трех глав, заключения, выводов и списка литературы. Список литературы включает 164 источника (в том числе 130 иностранных автора).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объекты исследований. В качестве объектов исследований использовали штаммы C. albicans. Непатогенный музейный штамм №4 C.albicans, полученный из коллекции музея ЦКВИ (г. Москва) и используемый на производстве при получении антигенных препаратов – как отрицательный контроль и штамм № 228 C.albicans, выделенный от больной с клинически подтвержденным диагнозом (системный кандидоз кожи и слизистой) (г. Казань) - как положительный контроль (табл. 1). Также использованны, штаммы C. albicans, выделенные в микологической лаборатории КНИИЭМ, от пациентов в возрасте от 1 до 56 лет, находящихся на амбулаторном лечении, с клиническими признаками поверхностной кандидозной инфекции различной локализации (слизистых и кожных покровов). При отборе в группу клинически значимых штаммов учитывались клинические проявления заболевания и выявление C.albicans в количестве, превышающем 103 КОЕ/мл. Группу клинически незначимых составили штаммы от пациентов без клинических признаков кандидоза, у которых выявлено менее 102 КОЕ/мл C.albicans. Всего протестировано 457 штаммов C. albicans.

Таблица 1.

Характеристика тест-штаммов C.albicans.

Штамм

Место выделения

Время достижения экспоненциального роста, часы

Образование ростковых трубок, %

Чувствительность к антимикотикам

№ 4

№228

Музейный

Слизистая ротовой полости

60

48

3%

42%

Чувствителен

*Слабо чувствителен

*Штамм устойчив к флуканозолу, полиеновым антибиотикам (нистатин, амфоторицин), клотримазолу, кетоканозолу. Чувствителен к тербинафину и итраконазолу.

Определение видовой принадлежности штаммов

Выделение и посев материала, количественный учет клеток C. albicans

Штаммы грибов C. albicans выделялись от больных и условно здоровых лиц в зависимости от локализации микоза с помощью стерильного тампона из гигроскопической ваты с последующим смывом дистиллированной водой. Затем тампон помещали в стерильную пробирку с 2 мл дистиллированной воды [Аравийский с соавт., 2004].

Посев проводился на агаризованную среду Сабуро в две чашки Петри, причем в одну чашку добавлялся стрептомицин в количестве 70 ед/мл среды. Засеяные среды выдерживали в термостате при температуре 300С в течение 48-72 часа. Производили расчет численности клеток C. albicans в смыве с 1 тампона в 1 мл дистиллированной воды

Идентификация грибов C. albicans Применение специальных методик идентификации проводили после того, как на среде Сабуро получали колонии, отвечающие макро- и микроморфологическим признакам дрожжеподобных грибов C. albicans.

Идентификацию грибов C. albicans проводили в соответствии с рекоммендациями по «Диагностике микозов» [2004]. Проростковая проба, или тест на образование герминативных (проростковых, или зародышевых) трубок, тест ассимиляции углеводов, тест ферментации углеводов, выявление хламидоспор. Также, для идентификации использовалась коммерческая комбинированная тест-система «Auxacolor», выпускаемая фирмой BioRad.

Определение уровня адгезии штаммов C. albicans

Приготовление нитроцеллюлозной пленки

0.05 г нитроцеллюлозы растворяли при помощи магнитной мешалки 30-40 минут с добавлением 1.25 мл бутилацетата, 0.750 мл толуола и 0.06 мл глутарового альдегида. Через 3 минуты добавляли 1-3 капли гексана и снова перемешивали. Полученный раствор разливали в чашку Петри (d=10) и сушили под вентилятором. Через 15 минут в эту чашку Петри наливали дистиллированную воду и всплывшую пленку высушивали до воздушно-сухого состояния на фильтровальной бумаге [Медянцева с соавт., 1999].

Иммобилизация белков на нитроцеллюлозную пленку

1 вариант: 0.05 г белка разводили в 5 мл фосфатного буферного раствора с рН 7 и добавляли к растворенной нитроцеллюлозе и перемешивали при помощи магнитной мешалки. Затем добавляли 0.06 мл глутарового альдегида, 1-3 капли гексана и 3 минуты перемешивали. Полученный раствор разливали в чашку Петри (d=10) и сушили под вентилятором. Через 15 минут в эту чашку Петри наливали дистиллированную воду и всплывшую пленку высушивали до воздушно-сухого состояния на фильтровальной бумаге.

Pages:     || 2 | 3 | 4 | 5 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»