WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

анти-HLA-DR

ООО «Сорбент», Москва

PE

4.

анти-CD45

ООО «Сорбент», Москва

FITC

5.

анти-CD14

ООО «Сорбент», Москва

PE

6.

анти-TLR2

CALTAG Laboratories, USA

FITC

7.

анти-TLR4

CALTAG Laboratories, USA

FITC

8.

анти-CD105

CALTAG Laboratories, USA

PE

9.

aнти-IFN

CALTAG Laboratories, USA

FITC

10.

aнти-IL-10

CALTAG Laboratories, USA

PE

11.

aнти-IL-12

CALTAG Laboratories, USA

PE

12.

aнти-IL-1

R&D, USA

PE

13.

aнти-IL-8

R&D, USA

PE

14.

Мышиные IgG1

Becton Dickinson, USA

FIFC

15.

Мышиные IgG2a

Becton Dickinson, USA

PE

FITC – флюоресцеинизотоицианат

PE – фикоэритрин

В экстрактах эндометрия, миометрия, миоматозных узлов определяли концентрацию провоспалительных цитокинов IL-1, MCP-1, IL-8 методом ИФА на микроплашетном ридере «Multiscan ЕХ» (Labsystetems, Finland). Тканевые экстракты получали путем 3-х кратного замораживания и размораживания измельченных образцов ткани в равном объеме фосфатного буфера [Фримель Г., 1987]. Концентрацию цитокинов определяли с помощью тест-систем, характеристика которых представлена в таблице 2.

Таблица 2.

Характеристика тест-систем для ИФА, использованных в работе

Исследуемый показатель

Фирма-производитель

Чувствительность системы

IL-1

ООО «Цитокин», Россия

> 6,3 пг/мл

IL-8

ООО «Цитокин», Россия

> 9,8 пг/мл

МСР-1

BioSource International, США

> 1,7 пг/мл

Для количественной оценки экспрессии мРНК в ткани эндометрия, миометрия и миоматозных узлов использовали метод RT-PCR в режиме реального времени. Процедуру выделения тотальной РНК из ткани эндометрия проводили стандартным гуанидин-тиоцианат-фенол-хлороформным методом [Velden van V.H.J., е.а., 2003]. РНК переводили в комплементарную кДНК, используя коммерческий набор реагентов Онкоскрин RT (OOO «Генотехнология», Гематологический научный центр РАМН, лаборатория генной инженерии, Москва, Россия). Для оценки экспрессии в ткани эндометрия мРНК 2-микроглобулина и IL-8 использовались наборы праймеров, зондов и реагентов производства OOO «Генотехнология». ПЦР-амплификацию в режиме реального времени проводили на амплификаторе с оптической насадкой iCycler iQ (BIO RAD, USA). Для определения количества копий пар кДНК в исследуемых образцах строили калибровочную кривую для 2-микроглобулина и IL-8 с использованием серии десятикратных разведений образцов контрольной кДНК и рассчитывали нормализованного значения количества копий гена IL-8. Полученные результаты представлены как нормализованное количество копий в образце х 104 на мкл.

Статистическая обработка данных проводилась с расчетом среднего арифметического и ошибки среднего арифметического с использование программных компонентов пакета MS Office 2005. Достоверность различий показателей женщин с миомой матки по сравнению с контрольной группой определялась по t-критерию Стьюдента.

Результаты работы и их обсуждение

Для определения роли фагоцитарных клеток в механизмах, определяющих темп и тип роста миомы матки, нами была проведена оценка особенностей фенотипа и цитокинового профиля фагоцитарных клеток на системном и локальном уровнях в периферической крови и эндометрии пациенток с данным заболеванием.

Анализ данных, характеризующих экспрессию функциональных молекул фагоцитами, показал, что, независимо от темпа и типа роста опухоли, в периферической крови женщин с миомой матки отмечалось достоверное снижение уровня HLA-DR+, CD11b+ и CD16+ моноцитов по сравнению с аналогичными показателями у здоровых женщин (р<0,001 во всех случаях) (см. приложение).

Известно, что эти функциональные молекулы определяют участие фагоцитов в осуществлении цитотоксических реакций и фагоцитоза. Имеющиеся литературные данные свидетельствуют о непосредственном вовлечении этих рецепторов в осуществление противоопухолевого ответа фагоцитами. Показано, что опухолевая инвазия ассоциируется со снижением экспрессии МНС АГ II класса клетками иммунной системы [Foukas P.G., e.a., 2001] и с угнетением реакций антитело-зависимой клеточной цитотоксичности, опосредованной CD16+ моноцитами/макрофагами [Gordon I.O., Freedman R.S., 2006]. Вероятно, снижение экспрессии функциональных молекул периферическими моноцитами является одним из механизмов, определяющих нарушение противоопухолевой защиты и способствующих формирования доброкачественной опухоли в миометрии.

Изменения экспрессии сигнальных молекул TLR2 и TLR4, независимо от темпа роста опухоли, имели одинаковую направленность как у женщин с миомой матки стабильно малых размеров, так и у женщин с быстрорастущей миомой матки. Уровень периферических моноцитов и нейтрофилов, а также эндометриальных макрофагов, экспрессирующих на своей поверхности TLR4 молекулы был значительно повышен относительно показателей контрольной группы как у женщин со стабильно малой миомой (р<0,02, р<0,005 и р<0,001 соответственно), так и у женщин с быстрорастущей миомой матки (р<0,01, р<0,01 и р<0,05 соответственно). При этом мы не выявили каких-либо изменений экспрессии TLR2 молекул фагоцитами крови и эндометрия у женщин с миомой матки (р>0,05 во всех случаях).

Известно, что TLR4 молекулы определяют ответ фагоцитов на бактериальные токсины [Jiang D., e.a., 2006]. В последнее время было выдвинуто предположение, что в развитии миомы матки важную роль играет инфекционный фактор [Малышкина А.И., 2006]. Вероятно, выявленное нами увеличение уровня TLR4+ фагоцитов у всех женщин с миомой матки отражает вовлечение системы фагоцитарных клеток в ответ на инфекционные антигены.

Состояние фагоцитов эндометрия было ассоциировано с темпом роста миомы матки. Нами было установлено, что у женщин с нерастущей миомой матки стабильно малых размеров в эндометрии снижено содержание HLA-DR-позитивных макрофагов, но повышен уровень CD16+ фагоцитов (р<0,05 и р<0,02 соответственно). Быстрое увеличение размеров опухоли сопровождалось снижением содержания CD11b+ эндометриальных макрофагов (р<0,001).

CD16-позитивным фагоцитам принадлежит важная роль в развитии цитотоксических реакций в отношении трансформированных клеток [Ancuta P., e.a., 2006], поэтому повышение содержания этой функционально активной популяции эндометриальных макрофагов у женщин с нерастущей миомой матки может свидетельствовать о достаточно высоком уровне цитотоксической активности макрофагов, определяющем отсутствие роста уже сформировавшейся миомы матки. CD11b молекулы, относящиеся к классу 2-интегринов, участвуют в осуществлении межклеточных взаимодействий по типу клетка-клетка и клетка-внеклеточный матрикс [Wu R., e.a., 2006], а интегрины, в свою очередь, играют важную роль в регуляции межклеточных взаимодействий при опухолевом росте [Brakebusch C., e.a., 2002]. По-видимому, нарушение взаимодействия эндометриальных макрофагов с другими клетками может приводить к снижению противоопухолевой защиты в ткани, непосредственно прилегающей к миометрию, провоцируя быстрый рост миомы матки.

При дифференцированном анализе данных, характеризующих экспрессию на поверхности фагоцитов функциональных и сигнальных молекул в зависимости от типа быстрого роста миомы нами было установлено, что повышение в периферической крови содержания нейтрофилов, экспрессирующих на своей поверхности рецептор к TGF1 – эндоглин (CD105), было ассоциировано с «истинным» типом роста опухоли за счет усиления пролиферативных процессов в миометрии (р<0,002). В то же время для подгруппы женщин с «ложным» типом роста миомы матки было характерно сниженное содержание периферического пула моноцитов, экспрессирующих молекулы эндоглина (р<0,05).

Эндоглин является вспомогательным рецептором TGF1 [Wipff J., е.а., 2007] и регулирует ангиогенез [Hayrabedyan S., e.a., 2005; Duwel A., е.а., 2007], определяя реализацию биологического действия этого фактора роста при опухолевом росте. Известно, что TGF ингибируют многие функции фагоцитарных клеток [Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В. и соавт. 2007; Kuo Y. e.a., 2001]. Поэтому повышение уровня экспрессии эндоглина периферическими нейтрофилами может вести к угнетению функциональной активности данной клеточной популяции, что, по-видимому, связано с усилением процессов опухолевого роста у пациенток с миомой матки.

Известно, что в ткани миоматозных узлов значительно изменяется по сравнению с неизмененным миометрием содержание ряда провоспалительных цитокинов и факторов роста [Nowak R.A., е.а., 2000; Sozen I., е.а., 2002]. Принимая во внимание тот факт, что фагоциты являются одними из основных продуцентов цитокинов в организме, можно предположить, что изменения локального цитокинового фона в миоме матке связано с нарушением секреторной активности фагоцитов крови и эндометрия. В связи с этим мы оценили характер внутриклеточной продукции ряда провоспалительных цитокинов мононуклеарными и гранулоцитарными фагоцитами при миоме матки (см. приложение).

Независимо от темпа роста миомы матки в периферической крови и эндометрии было выявлено значительное повышение содержания мононуклеарных фагоцитов, продуцирующих внутриклеточно IL-10 (см приложение). В последние годы получила широкое распространение теория о различной роли М1 и М2 макрофагов в регуляции опухолевого роста [Van Ginderachter J.A.,е.а.; 2006, Mantovani A., е.а., 2004]. Считают, что М1 или «классически» активированные макрофаги продуцируют цитокины Th1 типа и при активации участвуют в защите организма от опухолевых клеток. М2 клетки или «альтернативно» активированные макрофаги, активируются под воздействием Th2 цитокинов Th2 типа и могут влиять на поведение опухолевых клеток, изменяя опухолевое микроокружение и изменяя направленность противоопухолевого иммунного ответа, участвуя таким образом в росте и прогрессии опухоли [Van Ginderachter J.A., 2006]. Принадлежность к М2 популяции является высокая продукция IL-10 и низкая – IL-12 [Mantovani A., е.а., 2004]. Складывается впечатление, что в основе нарушений регуляции противоопухолевого ответа, ведущих к формированию миомы матки, является увеличение пула М2 фагоцитов как на системном, так и на локальном уровнях.

Темп роста опухоли, по нашим данным, был ассоциирован с различной направленностью изменений продукции провоспалительных цитокинов фагоцитарными клетками. У женщин с миомой матки стабильно малых размеров отмечалось достоверное снижение уровня моноцитов, нейтрофилов крови и эндометриальных макрофагов, экспрессирующих внутриклеточно IL-1 (р<0,05, р<0,05 и р<0,001 соответственно) и IL-8 (р<0,01, р<0,05 и р<0,05 соответственно). Быстрый рост миомы матки, напротив, сопровождался резким увеличением уровня IL-1+ (р<0,01, р<0,02 и р<0,001 соответственно), IL12+ (р<0,01, р<0,02 и р<0,001 соответственно), IL-8+ (р<0,001 во всех случаях) и IFN+ клеток (р<0,05, р<0,001 и р<0,001 соответственно) в популяциях моноцитов и нейтрофилов периферической крови, а также в популяции эндометриальных макрофагов. На основании выявленных закономерностей изменения содержания моноцитов, продуцирующих IL-8, в зависимости от темпа роста миомы матки, был предложен новый диагностический критерий быстрого роста миомы матки.

Связь между воспалением и канцерогенезом была установлена достаточно давно [Lin W.W.,е.а., 2007; Balkwill F., е.а., 2007]. На сегодня можно считать доказанным, что хроническое воспаление усиливает опухолевую прогрессию [Allavena P., е.а., 2008]. В связи с этим, выявленное нами усиление продукции провоспалительных цитокинов периферическим и эндометриальными макрофагами только у женщин с быстрорастущей миомой матки представляется вполне логичным.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»