WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |

Агроценоз 3

Исследуемые микроорганизмы

А) В работе были использованы аборигенные штаммы грибов Trichoderma выделенные нами из антропогенно-нарушенной почвы на территории РТ. Штамм T. asperellum 302, выделенный из погребенной почвы Мурзихинского II могильника (Алексеевский район, РТ), использован в качестве контроля – не затронутого антропогенным воздействием при изучении ферментативной активности и влияния тяжелых металлов.

Б) Грибы: Alternaria tenuis, Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Cladosporium herbarum, Fusarium oxysporum, Mucor pusillus, Neurospora sitophila, Penicillium digitatum, Penicillium chrysogenum, Penicillium tardum, Phoma Betae, Rhizopus nigricans, Saccharomyces cerevisiae и Trichophyton rubrum (коллекции КНИИЭМ) использованы для изучения перекрестных реакциий аллергенов.

Изучение биологической активности почвы

Исследование содержания тяжелых металлов определяли ITP-спектрометрией на атомно-эмиссионном спектрометре Optima-2000DIV. Минеральный состав почв определяли с помощью фазового рентгеновского анализа (рентгеновский дифрактометр D8 ADVANCE, Bruker).

Активность азотфиксации в почве измеряли методом Харди в модификации Умарова [Гарусов с соавт., 2006], определение активности почвенного дыхания осуществляли на газовом хроматографе [Гарусов с соавт., 2006]. Определение углерода активной микробной биомассы проводили по интенсивности выделения СО2 из почвы, обогащенной субстратом (Vsir) [Благодатская, Ананьева, 1996].

Определение уреазной активности почвы проводили методом Колешко [Хазиев, 2005], целлюлозолитической активности почвы – аппликационным методом [Хазиев, 2005], протеолитической активности почвы методом Галстяна [Хазиев, 2005], каталазной активности почвы методом Канцельсона и Ершова [Хазиев, 2005].

Определение биомассы микроорганизмов в почве проводили методом прямого счета в люминесцентном микроскопе по Звягинцеву и Кожевину [Головченко и др., 1995; Кожевин, 1989; Методы …, 1991], определение структуры сообществ проводили на плотных питательных средах, численности – на плотных и жидких питательных средах [Захарова с соавт., 2005]. Идентификацию актиномицетов проводили по [Зенова, 1992].

Изучение грибов рода Trichoderma

Выделение Trichoderma из образцов почвы проводили методом серийных разведений с последующим высевом на среду с пароморфогенным веществом [Бенкен, Хацкевич, 1972]. Моноспоровые культуры грибов получали методом Лихачева [1994] на жидких питательных средах с добавлением глицерина до получения ими определенной вязкости.

Морфолого-культуральные свойства изучали на минеральной среде, картофельно-глюкозном агаре (КГА), среде Чапека-Докса с низким содержанием сахарозы[Захарова с соавт., 2005; Алимова, 2006], специальном питательном агаре (SNA) [по Samuels et al., 1998]. Для культивирования использовали как твёрдые (агаризованные), так и жидкие среды.

Идентификация по морфологическим признакам проводилась по ключу Александровой [Александрова с соавт., 2001], Samuels [2003] и Шавери [Chaverri et al., 2003]. Размеры объектов замеряли с помощью окуляр–микрометра.

Определение цвета колонии, что необходимо для описания изолятов проводили двумя способами. С помощью шкалы Бондарцева [1959] и с помощью модели RGB. Модель RGB описывает излучаемые цвета и основана на трех базовых цветах - Red (Красный), Green (Зеленый), Blue (Синий). Остальные цвета образуются при смешивании этих трех основных.

Вегетативную совместимость моноспоровых клонов изучали сращиванием от двух до восьми колоний на чашках Петри на среде картофельно-глюкозный агар, с последующим визуальным наблюдением за поведением колонии и микроскопированием пограничной зоны между колониями, что позволило наблюдать за анастомозами и оценить относительную частоту их образования. Характер проявления реакций при визуальной оценке и микроскопировании сравнивали с описаниями, приведенными у Дьякова и Долговой [1995].

Антагонистическую активность и конкурентоспособность изолятов Trichoderma определяли методом встречных культур на среде Чапека, КГА [Симонян и Мамиконян, 1982].

Гетерогенность популяций выделенных изолятов оценивали по их разделению на культурально-морфологические типы (КМТ) и появлению секторов при росте на чашках Петри [Дьяков, 1998].

Определение ксиланазной и протеазной активностей изолятов Trichoderma проводили по Кониг [Konig, 2002] на средах: с высокой концентрацией сложных углеводов (отход спиртового производства) и щелочном ржаном экстракте.

Определение фитотоксичности почвы и КЖ проводили на семенах злаковых и микрорастениях картофеля [Методы …, 1991].

Выделение ДНК проведено фенол/хлороформным методом, ПЦР-анализ по [Druzhinina et al., 2005]. Исследовались участки ядерной рДНК, содержащий ITS1 и 2 и гена tef1. Режимы ПЦР - амплификации: а) денатурация ДНК - 950С; 1 мин, б) отжиг праймеров - 540С; 1,5 мин, в) элонгация - 720С; 1 мин. Результаты ПЦР оценивались в агарозном и полиакриламидном гелях различной концентрации. Результаты секвенирования фрагмента гена tef1 обрабатывали при помощи пакета программ Lasergene 5.03 (DNASTAR, Inc., США). Программа SeqMan использовалась для анализа секвенсных хроматограмм. Программа MegAlign использовалась для выравнивания последовательностей и экспорта их в формате GCG.

Определение генотоксичности Trichoderma проводили полуколичественным методом учета генных мутаций (тест Эймса) [Ames, Lee, 1973].

Изучение морфологии поверхности спор Trichoderma проводили полуконтактным методом на атомно-силовом микроскопе NTEGRA Prima (NT-MDT) [Миронов, 2004; Бухараев с соавт., 2006].

Для изучения влияния ионов металлов на морфологию Trichoderma и свойства антигенных препаратов грибов использовали следующие соли: ZnSO4 x 7H2O, NiNO3, CuSO4 x 5H2O, FeSO4 x 7H2O, AlCO3 x 6H2O в концентрациях: 0.05, 0.1, 0.2, 0.4 и 0.8 мг/мл.

Изучение накопления частиц меди на поверхности Trichoderma проведено вольт-амперометрическим методом [Абдуллин с соавт., 2007].

Определение количества белка проводили по Брэдфорду [Северин, Соловьева, 1989], нуклеиновых кислот – по Спирину [Северин, Соловьева, 1989], реакцию преципитации – по Оухтерлони методом встречной иммунодиффузии [Китти, 1991], гель-хроматографического профиля антигена – с использованием сефадекс-100 [Фримель, 1987].

Статистическую обработку результатов проводили с помощью электронных таблиц Microsoft Excel, Statgraphics plus 2.1. Взаимосвязь ряда факторов устанавливали посредством расчета коэффициента корреляции. Для сравнения применяли интервальные оценки. Уровень значимости, примененный в работе, Р‹ 0,05. Данные в таблицах представлены как среднее ± 2стандартное отклонение, в графиках – в виде структурных характеристик (медиана, персентили 0.025, 0.975).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1 Характеристика почв Юго-Восточного Закамья

1.1 Содержание тяжелых металлов в почве

При оценке экологической опасности почвенного загрязнения тяжелыми металлами (ТМ) принимается во внимание не только его интенсивность, но и состав загрязнителей, и, в первую очередь, присутствие элементов, относимых к 1 и 2 классам гигиенической опасности в соответствии с ГОСТ № 17.4.1.01-83. Нами исследовано загрязнение следующими металлами: 1 класс - мышьяк (As), ртуть (Hg), свинец (Pb), цинк (Zn), кадмий (Cd) и 2 класс - медь (Сu), хром (Cr) и кобальт (Co). Очаги техногенного загрязнения, как правило, представляют собой избыточную концентрацию не одного, а целого комплекса химических элементов. Каждый из них может быть охарактеризован с помощью коэффициента концентрации химического вещества (Кс), который определяется отнесением его реального содержания в почве (С) к фоновому (Сф) (табл. 1).

Таблица 1

Коэффициент концентрации загрязнителя (Кс) в исследованных почвах

Образцы

Металлы

As

Pb

Hg

Zn

Cu

Ni

Zc

Контроль (фон)

1.98

0.55

0.16

0.63

0.88

1.29

5.49

Агроценоз 1

2.98

0.48

0.35

0.85

1.37

4.11

7.82

Агроценоз 2

2.73

0.55

0.80

0.92

1.61

1.60

6.78

Агроценоз 3

2.27

0.60

0.23

0.72

1.52

3.18

8.04

Л1 (луг 6 лет)

1.91

0.63

0.19

0.82

1.56

1.79

9.23

Л2 (луг 2 г.)

1.25

0.49

0.28

0.72

1.44

1.42

7.35

Л3 (луг 2 мес.)

3.62

0.46

0.30

1.09

1.50

1.44

8.56

С1 (скважина 1)

1.21

0.37

0.67

0.81

1.60

1.64

6.32

С2 (скважина 2)

2.00

0.53

0.20

0.90

2.04

2.42

8.08

НП (разлив нефтепродуктов)

3.00

0.46

0.30

0.81

1.42

1.28

7.27

Кс металла для всех образцов*

2.30± 1.57

0.51± 0.16

0.35± 0.44

0.83± 0.25

1.49± 0.57

2.02± 1.89

Для характеристики интегрального воздействия химических элементов на окружающую среду использован суммарный показатель загрязнения Zc. Как показали результаты, образцы почв характеризуются минимальным уровнем загрязнения (Zc<8) по исследованным ТМ.

В качестве условного контроля (фоновая почва) была выбрана целинная почва под растительной формацией. Исследованная почва в основном имеет низкие значения Кс, а также характеризуется наименьшим значением суммарного показателя загрязнения (5.49).

Наибольшее превышение фонового содержания отмечено для мышьяка, меди и никеля. Считается, что самыми сильными источниками загрязнения мышьяком являются гербициды, фунгициды и инсектициды. Это согласуется с полученными нами данными – высокие значения Кс мышьяка отмечены в образцах, отобранных в агроценозах, где могли использоваться эти химикаты.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»