WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

А

G

G

G

T

Больной псориазом

Отец №3

18 лет

Легкая

Н-

Вульгарная

2

Ж

37

G

A

G

G

G

T

Родственник

Мать №3

Н-

3

Ж

16

G

A

G

G

G

T

Больной псориазом

Дочь №1,2

15 лет

Средняя

Н+

Вульгарная

4

М

32

G

G

G

G

G

T

Больной псориазом

Сын №5

12 лет

Тяжелая

Н+

Вульгарная

5

М

53

G

G

G

G

G

T

Больной псориазом

Отец №4

29 лет

Легкая

Н-

Вульгарная

Условные обозначения: М-мужчина, Ж-женщина, Н+-отягощенная наследственность по псориазу, Н--наследственность по псориазу не отягощена

Для определения полиморфизма RAGE-гена нами была сконструирована тест-система, основанная на полимеразной цепной реакции. В предложенной тест-системе профиль амплификации представлял собой 40 циклов, проводимых в следующем режиме:

1-й этап – денатурация геномной ДНК, выделенной из лейкоцитарной массы цельной крови после предварительной отмывки лейкоцитов раствором Канкеля при температуре 93° С (длительность шага 10 секунд);

2-й этап – отжиг (омелинг) праймеров который осуществлялся при температуре 64° С (длительность шага 10 секунд); При проведении ПЦР были использованы специально подобранные праймеры (1RAGE2184 (GGCCTCAGGACCAGGGAACCTACA), 8551-8574 п.о., и 2RAGE2184 (TTGGTCAGGCTGGTCTCGAACTCC), 8929-8952 п.о.), которые позволяли фланкировать участок ДНК, содержащий RAGE-ген и провести его амплификацию для последующего изучения методом рестрикции.

3-й этап – элонгация происходила при повышении температуры до 72° С (длительность шага 10 секунд).

Определение полиморфизма RAGE-гена на основе последовательности гена представленной в GenBank - D28769 проводилось с помощью метода рестрикционного анализа нуклеотидных последовательностей согласно методике, описанной V.Vasku со соавторами (2002).

Сайт RAGE 2184A/G: рестрикцию продуктов амплификации мы проводили в присутствии эндонуклеазы BsmF1 из Bacillus stearothermophilus F (New England Biolabs) с целью получения фрагментов длиной 266 и 136 п.о. для

аллели А и 174, 136 и 92 п.о. для аллели G.

Продукты амплификации инкубировали при температуре 65°С в течение 4 часов, после чего осуществляли инактивация фермента в течение 20 минут при температуре 80° С.

Сайт RAGE 1704G/Т: рестрикцию проводили в присутствии эндонуклеазы ВfaI из Bacteroides fragilis (New England Biolabs). Продуктами рестрикции для аллеля G явились участки ДНК длиной 240, 143 и 42 п.о.; для аллеля Т: 240 и 185 п.о.

Продукты амплификации инкубировали в течении 5 часов при 37° С. Инактивацию фермента осуществляли в течение 20 минут при температуре 80° С.

Сайт G82S: рестрикцию продуктов амплификации проводили в присутствии эндонуклеазы Аlu I из Arthrobacter luteus (New England Biolabs). При диком (немутантном) типе (GG) данного аллеля продуктами рестрикции были фрагменты ДНК длиной 123, 26, 248 п.о.; при мутантном типе (АG): 123, 26, 67 и 181 п.о.

Продукты амплификации инкубировали при температуре 37°С в течение 4 часов, после чего осуществляли инактивацию фермента в течение 20 минут при температуре 65° С.

Анализ полиморфизма длины полученных рестрикционных фрагментов осуществляли с помощью горизонтального электрофореза в 3%-ном агарозном геле в присутствии маркеров молекулярных масс («CибЭнзим», Новосибирск) от 100 до 1000 п.о. (таблица 2)

Таблица 2

Условия проведения рестрикции и продукты рестрикции RAGE-гена

Сайт RAGE-гена

Эндонуклеаза

Продукты рестрикции (длины фрагментов)

Изучаемые аллели

2184А/G

BsmF1 из Bacillus stearothermophilus F (New England Biolabs)

266 п.о.

136 п.о.

А

174 п.о.

136 п.о.

92 п.о.

G

1704 G/T

ВfaI из Bacteroides fragilis (New England Biolabs)

240

143

42

G

240 п.о.

185 п.о.

Т


G82S

Аlu I из Arthrobacter luteus (New England Biolabs)

123 п.о.

26 п.о.

248 п.о

GG


123 п.о.

26 п.о.

67 п.о.

181 п.о.

АG

Документирование гелей проводили с помощью оптической системы “BIORAD” (USA) и с использованием программы “Гель-Док” (рис.2,3,4,5).

Рис. 2

Продукты амплификации RAGE 2184 (402 п.о.)

Рис. 3

Результаты рестрикционного анализа RAGE 2184 A/G

Рис. 4

Результаты рестрикционного анализа (аллельный полиморфизм RAGE G82S)

Рис. 5

Результаты рестрикционного анализа (аллельный полиморфизм RAGE 1704G/T

Результаты исследований

Средний возраст в группе больных псориазом составил 33,7 года, в группе сравнения – 36,8 года, в контрольной группе – 33,3 года и в группе здоровых родственников 35,1 года. Среди больных псориазом было 22 мужчины и 30 женщин; в группе сравнения – 10 мужчин и 7 женщин; в контрольной группе – 2 мужчины и 5 женщин; в группе здоровых родственников – 14 мужчин и 25 женщин (таблица 3).

Таблица 3

Характеристика групп обследуемых

Группы

Кол-во

Возраст, лет

 

М

Ж

Всего

Мин.

Макс.

Средний

Стандартное отклонение

I группа (больные псориазом)

22

30

52

7

75

33,7

15,2

II группа (сравнения)

10

7

17

6

61

36,8

16,3

Атопический дерматит

6

3

9

6

35

18,6

8,7

КПЛ

3

2

5

33

61

45,8

11,2

Ихтиоз

1

2

3

11

34

21,7

11,6

III группа (здоровые родственники)

14

25

39

6

79

35,1

16,2

IV группа (контрольная)

2

5

7

24

58

33,29

12,27

Псориаз легкой степени (PASI12) тяжести наблюдался у 12,5% пациентов, средней степени тяжести (PASI от 13 до 45) - у 70,83% и тяжелой степени тяжести (PASI46) - у 16,67% пациентов. Отягощенный по псориазу семейный анамнез был установлен у 40,48% пациентов (таблица 4).

Таблица 4

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»