WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

T1, Т2,

Т3

N1,

N0, N1

M0

M0

IVA

T1, Т2, T3,

T4

N2,

N0, N1, N2

M0

M0

IVB

T4b

Любая T

Любая N

N3

M0

M0

IVC

Любая T

Любая N

M1

Методы исследования

Геномная ДНК, полученная из лимфоцитов периферической крови и биопсийного материала, была выделена с использованием протеиназы К с последующей фенол-хлороформной экстракцией (Дейвис К., 1990). Генетическую информацию вируса папилломы человека в ДНК, выделенную из биопсийного и операционного материала, выявляли методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Амплификация фрагментов ДНК папилломавирусов 6, 11, 31, 33, 16 и 18 типов проводилась по стандартной программе на амплификаторе «Термоцик МС2», с регулированием температуры по матрице (скорость нагрева-охлаждения не менее 1оС/сек). Для визуализации продуктов амплификации применяли 2,5% агарозный гель. Для определения ДНК ВПЧ использовали коммерческие наборы фирмы «Амплисенс» (ФГУН ЦНИИЭ, Москва).

Определение латентного мембранного протеина (LMP-1) вируса Эпштейна-Барр проводили иммуногистохимически, авидин-биотиновым методом с использованием моноклональных антител Epstein-Barr Virus (latent membrane protein) – NCL-EBV-CS1-4 (Novocastra Laboratories Ltd) на серийных парафиновых срезах, сделанных из биопсийного и операционного материала лиц со злокачественной патологией гортани, проходивших лечение в клинике ГУ НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН г. Томска в период с 2005 по 2007 гг.

Уровни специфических антител к антигенам литической инфекции ВЭБ (IgG и IgА к вирусному капсидному антигену, IgG к комплексу ранних антигенов) в сыворотке периферической крови обследуемых лиц определяли методом непрямой иммунофлюоресценции (Henle W., 1979).

Оценку полиморфизма генов ферментов детоксикации ксенобиотиков GSTT1 и GSTM1 (кодируют соответственно глутатион S-трансферазы 1 и 1) проводили с помощью мультиплексной ПЦР с использованием трех пар олигонуклеотидных праймеров, специфичных к участку гена рецептора эстрогенов, ER (F: 5'-caa-gtc-tcc-cct-cac-tcc-cc; R: 5'-gtg-cga-gtg-gct-cag-tgt-gt) и генов GSTT1 (F: 5'-ggt-cat-tct-gaa-ggc-caa-gg; R: 5'-ttt-gtg-gac-tgc-tga-gga-cg), и GSTM1 (F: 5'-tgc-ttc-acg-tgt-tat-gga-ggt-tc; R: 5'-gtt-ggg-ctc-aaa-tat-acg-gtg-g) (Spurdle A.B. et al., 2001). Продукты амплификации фракционировали в 3%-ом агарозном геле с добавлением бромистого этидия в течение 30 мин при напряжении 130 В и визуализировали в УФ-свете (рис.1).

Рис. 1. Примеры идентификации 0/0 и + генотипов по генам GSTT1 и GSTM1: ER – контроль амплификации (183 п.н.); 1 – генотип GSTT1 0/0 GSTM1 0/0; 2, 5, 7 – GSTT1 + GSTM1 + (131 и 114 п.н. соответственно); 3, 4, 6 – GSTT1 0/0 GSTM1 +; 8 – GSTT1 + GSTM1 0/0.

Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета прикладных программ «Statistica for Windows 6.0». При сравнении частот генотипов применяли стандартный критерий Пирсона (2). В случае малого объема выборки (5 человек) использовали критерий Пирсона с поправкой Йетса и критерий Фишера. Для оценки ассоциации между генотипами и риском развития заболевания рассчитывали отношение шансов (OR-odd ration). OR указывался с 95% доверительным интервалом (Confidence interval - Cl). Прогностическая значимость признаков в отношении общей и безрецидивной выживаемости у больных РГ оценена с использованием программы Survival Analysis, STATISTICA 6.0. Кривые кумулятивной выживаемости строились по методу Каплана-Майера. Значимость различий в выживаемости между группами оценена по критерию Гехана-Вилкоксона.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В ГУ НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН на протяжении ряда лет проводились исследования по изучению распространенности вируса Эпштейна-Барр среди населения Сибири и Дальнего Востока, кроме того, изучалась его роль как фактора прогноза и формирования групп повышенного риска развития опухолей различных локализаций, в том числе, области головы и шеи (Исаева Т.М., 1992; Чойнзонов Е.Л., 1997). Литературные данные относительно вклада вируса папилломы человека в патогенез рака гортани разноречивы и, зачастую, диаметрально противоположны. Кроме того, практически, не встречается работ, посвященных изучению частоты встречаемости ВПЧ у лиц, страдающих хроническим гиперпластическим ларингитом и папилломатозом гортани, которые официально признаны факторами риска развития РГ и рассматриваются как заболевания с высокой частотой малигнизации. На первом этапе нашей работы была изучена частота ассоциации рака и предопухолевых заболеваний гортани с вирусом папилломы человека и проведено сопоставление изученного показателя с клинико-морфологическими особенностями опухолевого процесса.

Максимальный уровень инфицирования вирусом папилломы человека был зарегистрирован у больных РГ (20,0%), значимо различаясь с таковым в контрольной группе (5,4%), в то время как у пациентов с ПЗГ значение данного показателя составило 8,7% (рис.2).

Следует отметить, что у больных раком гортани ВПЧ инфицирована как опухолевая (16%), так и прилежащая к ней, нормальная (5,0%) ткань, тогда как у больных предопухолевыми заболеваниями и лиц контрольной группы ВПЧ был детектирован только в нормальной ткани в 8,7% и 5,4% случаях, соответственно. Изучение частоты инфицированности как нормальной, так и опухолевой ткани гортани одним или несколькими типами ВПЧ, показало преобладание в нормальной ткани больных РГ моно-инфекции (13,0%), а в опухолевой ткани - микст (6,0%). У больных предопухолевыми заболевания гортани оба типа инфицирования были обнаружены с одинаковой частотой – в 4,0% случаев. При этом в контрольной группе обнаружено только микст-инфицирование (5,4%).

Исследование спектра инфицирования ВПЧ эпителиальной ткани гортани среди больных и лиц контрольной группы показало, что наиболее часто во всех трех группах выявляются 6 и 11 типы вируса. Так, у больных РГ данные типы обнаружены в 10 и 7,0% случаев, соответственно, тогда как среди больных предопухолевыми заболеваниями гортани и в контрольной группе ВПЧ 6 и 11 были обнаружены с одинаковой частотой – в 4,0% случаев. ВПЧ 31 и 33 были определены у больных РГ и в контрольной группе в равном проценте случаев – 2,0%.

Рис.2. Частота встречаемости вируса папилломы человека в изученных группах больных и контрольной. Примечание: * - статистически значимые различия с контрольной группой (р0,05).

Следует отметить, что в группе больных РГ спектр инфицированности опухолевой ткани был шире по сравнению с нормальной тканью. Так, кроме ВПЧ 6, 11, 31 и 33, представленных в нормальной ткани, в опухолевой дополнительно были выявлены ВПЧ 16 и 18 в 1,0% и 2,0% случаев, соответственно.

При сопоставлении частоты детекции и спектра инфицированности ВПЧ с таким клинически значимым параметром, как стадия заболевания, были получены следующие результаты. При одинаковом уровне инфицированности нормальной ткани больных со II и III стадией опухолевого процесса, у пациентов с III стадией заболевания частота выявления ВПЧ в опухолевой ткани в два раза превышала значение этого показателя у больных со II стадией (рис. 3, 4). Однако при детальном рассмотрении зависимости спектра типов ВПЧ от стадии опухолевого процесса было установлено, что у больных с III стадией диапазон вирусов папилломы человека, инфицирующих нормальную ткань, более широк. Кроме 6 и 11 типов вируса, присутствие которых было отмечено также и в нормальной ткани больных со II стадией, у больных с III стадией были определены с одинаковой частотой 31 и 33 типы. Аналогичная тенденция отмечена при сравнении спектра ВПЧ в опухолевой ткани больных РГ. Максимальный спектр типов ВПЧ был зафиксирован в опухолевой ткани больных с III стадией опухолевого процесса. Помимо 6, 11 и 31 типов ВПЧ, обнаруженных в опухолевой ткани больных со II стадией процесса, у больных с III стадией дополнительно и с одинаковой частотой (13,0%) были определены 33, 16 и 18 типы.

Рис. 3. Частота детекции вируса папилломы человека в нормальной ткани больных раком гортани со II и III стадией опухолевого процесса.

Аналогичная тенденция наблюдалась при изучении спектра инфицированности и частоты детекции ВПЧ в ткани больных РГ во взаимосвязи со степенью дифференцировки опухоли. Так, у больных с высокой степенью дифференцировки частота детекции вируса в нормальной и опухолевой ткани была, примерно, равнозначна. Однако, в опухолевой ткани, помимо ВПЧ 11, выявленного и в нормальной ткани, присутствовал ВПЧ 6 (7,0%). Спектр инфицированности как опухолевой, так и нормальной ткани больных РГ с умеренной степенью дифференцировки опухоли был более широким. Кроме ВПЧ, выявленных у больных с высокой степенью дифференцировки, у больных с умеренно-дифференцированной опухолью обнаружены ВПЧ 16 и 18 (в 2,0 и 3,0% случаев, соответственно). Причем, с максимальной частотой и в опухолевой (в 9,0 и 5,0% случаях, соответственно), и в нормальной ткани (в 11,0 и 8,0% случаях, соответственно) были обнаружены 6 и 11 типы ВПЧ. С одинаковой частотой (2,0%) в обеих типах эпителиальной ткани гортани больных РГ выявлены ВПЧ 31 и 33.

Рис. 4. Частота детекции вируса папилломы человека в опухолевой ткани больных раком гортани со II и III стадией опухолевого процесса.

Поскольку, от момента инфицирования до возникновения опухоли проходит продолжительный латентный период, длящийся годами, а иногда и десятилетиями, мы сочли целесообразным изучить частоту встречаемости и спектр ВПЧ во взаимосвязи с длительностью течения заболевания, для чего больные РГ были разделены на соответствующие подгруппы (длительность заболевания менее 0,5 лет; 0,5-2 и 2-4 года). Показано 2,4- и 1,2-кратное увеличение частоты встречаемости ВПЧ в опухолевой ткани больных РГ, заболевание которых длилось 0,5-2 и 2-4 года, соответственно, по сравнению с больными с минимальным сроком развития патологического процесса. Тенденция инфицирования нормальной ткани больных была подобна предыдущей, однако, у больных с максимальным сроком развития заболевания частота детекции вируса была в 1,5 раза ниже, чем у лиц с 0,5-2-летним и составила 9,0%. Следует отметить, что нормальная ткань больных именно с минимальным периодом развития опухолевого процесса была инфицирована, помимо ВПЧ 6, 11, вирусами папилломы 31 и 33 типа, чего не наблюдалось ни в одной другой подгруппе больных. Тогда как, в опухолевой ткани присутствовал только 6 тип вируса. В подгруппе больных с продолжительным течением заболевания частота и спектр инфекции, напротив, были наиболее широко представлены в опухолевой ткани (ВПЧ 6, 11, 16 и 18), тогда как в нормальной были выявлены только 6 и 11 типы.

У больных с предопухолевыми заболеваниями гортани различий в частоте инфицированности ВПЧ между подгруппами показано не было. Однако нормальная ткань пациентов с минимальным сроком развития заболевания была инфицирована 6 и 11 типами, тогда как у больных с 2-4-летним процессом – ВПЧ 31. Таким образом, присутствие ВПЧ 31 типа в нормальной слизистой гортани больных раком и предопухолевой патологией неоднозначно влияет на длительность течения патологического процесса.

Существуют разные точки зрения на причинно-следственные аспекты вирусного канцерогенеза. Так, связь между инфицированностью эпителия у больных с предопухолевой патологией гортани и тяжестью течения заболевания объясняется наличием латентной инфекции в морфологически здоровой ткани, прилегающей к патологическому очагу (Плужников М.С. и др., 2006). Согласно гипотезе, предложенной Г.Ф. Иванченко и др. (2001), не исключая вклада вирусной составляющей, ведущая роль в поддержание и прогрессирование патологического процесса отводится особенностям макроорганизма, в частности, дефициту системы интерферона и показателей Т-клеточного звена иммунитета, регистрируемому у 98% больных рецидивирующим респираторным папилломатозом. О важности CD4+ и/или CD8+ - Т-клеточных реакций в контроле ВПЧ-инфекции, в том числе, частоты ее рецидивирования у больных с Т-клеточной иммуносупрессией, свидетельствует и большое число заболеваний, ассоциированных с ВПЧ различных типов (Benton C. et al., 1992). Вышесказанное подтверждается, также, гистологическими исследованиями, выявляющими, в случаях самопроизвольной регрессии папиллом, наличие Т-клеточной инфильтрации в биоптатах кожи и слизистых оболочек (Berman A. et al., 1980; Iwatsuki K. et al., 1986; Delius H. et al., 1998). Данный факт подтверждается данными, согласно которым, развитию и прогрессированию вирусной инфекции у 48% больных папилломатозом гортани способствует дибаланс Th1/Th2 (Clerici M. et al., 1998; Snowden T.R. et al., 2001).

Оценив риск развития рака гортани у лиц, инфицированных папилломавирусами, нами установлено, что инфицирование эпителия гортани больных РГ ВПЧ 6 ассоциировало с 8,5-кратным риском развития злокачественной опухоли по сравнению с контрольной группой. При этом только у больных РГ и исключительно в опухолевой ткани были обнаружены 16 и 18 типы вируса папилломы, отсутствующие в других исследуемых группах. Отмечено, что только у больных с III стадией злокачественного процесса и умеренной степенью дифференцировки в опухолевой ткани обнаружено присутствие всех 6 изученных типов ВПЧ. Несмотря на получение определенных результатов относительно ассоциации ВПЧ с патологией гортани, их неоднозначность оставляет вопрос о вкладе вируса папилломы человека в этиопатогенез рака гортани открытым и требующим дальнейшего изучения и уточнения.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»