WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 |

Ген KRT7. Ген КРТ7 принадлежит семейству кератинов, представляющих собой большое семейство 8-нм промежуточных филаментов цитоскелета эпиталеальных клеток. КРТ7 представляет собой кератин II типа, состоящий из четырех -спиральных сегментов с гептановыми повторностями гидрофобных остатков, характерных для биспирального участка. Цитокератины относятся к маркерам клеток эпителиальной природы. В процессе злокачественной трансформации клеток способность экспрессировать определенный спектр цитокератинов, характерных для данного типа тканей, сохраняется и в клетках опухоли, развившейся в этих тканях (Moll et al., 1982). Так, муцинозная аденокарцинома яичников экспрессирует цитокератины простого эпителия (в том числе цитокератин 7) (Vang et al., 2006). При раке толстого кишечника сохраняется специфический набор цитокератинов, характерный для кишечника (включая цитокератин 20, но не цитокератин 7) (Cerna et al., 2006). В настоящий момент данных о спектре кератинов, синтезирующихся при РПЖ, нет.

В ходе обработки клеточных линий РПЖ ингибиторами метилирования 5-аза-2-деоксицитидином и трихостатином А, уровень экспрессии гена КРТ7 повысился приблизительно в семь раз в трех клеточных линиях (LNCaP – в 5 раз, MDA2b – в 12 раз, PC-3 – в 3 раза). Промоторная область данного гена содержит CpG островок длиной 952 п.н., GC состав = 68%, Н/Т = 0,76. Результаты секвенирования участка длиной 290 п.н., содержащего в своем составе 32 CpG динуклеотида, показали метилирование гена KRT7 в трех клеточных линиях LNCaP, DU-145, MDA2b, образцы нормальной ДНК и клеточной линии PC-3 были неметилированы (рис. 3).

Рисунок 3. Хроматограммы сиквенсов продуктов ПЦР, полученных при амплификации бисульфит-модифицированной ДНК промоторного участка гена КRТ7 в клеточной линии РПЖ MDA2b и в нормальной ткани предстательной железы (НП). Стрелками отмечено присутствие цитозина (С) в CpG-динуклеотидах в клеточной линии РПЖ и тимина (Т) – в нормальной ткани.

Результаты анализа частоты метилирования гена KRT7 в клинических образцах показали метилирование гена KRT7 в 53% случаев ПИН (10/19), в 70% случаев ранней стадии рака простаты (14/20), в 35% случаев поздней стадии (6/17). Таким образом, частота метилирования гена KRT7 при ПИН говорит о том, что изменение экспрессии гена KRT7, вызываемое эпигенетическими факторами, уже имеет место быть на стадиях, предшествующих раку предстательной железы. А высокий показатель метилирования при РПЖ ранней стадии свидетельствует о возможности использования гена KRT7 при ранней диагностике РПЖ.

Ген SLC15A3. Ген SLC15A3 является одним из четырех представителей SLC15 семейства, главной функцией которого является транспорт коротких пептидов в различные клетки. SLC15A1 преимущественно встречается в клетках эпителия кишечника и в протоках желчного пузыря, SLC15A2 – в эпителии почек, глии, легких, хороидного сплетения и молочной железы. SLC15A3 и SLC15A4 были открыты сравнительно недавно (Daniel et al., 2004). Их функция состоит в транспорте гистидина, но до сих пор остается не выясненным вопрос об их локализации. Предполагается, что они являются лизосомальными переносчиками гистидина из лизосом в цитоплазму, в качестве источника энергии использующие протонный потенциал. SLC15A3 преимущественно экспрессируется в эпителии легких, сердца, кишечника, предстательной железы и других органов. Изучение паттерна метилирования данного гена особенно интересно в свете последних данных, согласно которым переносчики семейства SLC15 участвуют в транспорте лекарственных препаратов (Li et al., 2006)

Эпигенетическая реактивация генома клеточных линий РПЖ явилась причиной повышения уровня экспрессии данного гена в 2,8-3,2 раза по сравнению с контрольными клетками. В ходе анализа CpG-островка, входящего в состав промотора было установлено, что первый экзон содержит в себе два CpG-островка. Первый CpG-островок имел следующие характеристики: длина - 211 п.н., состав GC = 52%; Н/Т = 0,57. Длина второго CpG-островка составляла 651 п.н., состав GC был равен 69%; Н/Т = 0,73. Для дальнейшей работы был выбран второй CpG-островок, так как он имел лучшие показатели и располагался ближе к сайту старта транскрипции. Результаты секвенирования показали метилирование во всех четырех клеточных линиях рака предстательной железы. На рис. 4 приведены хроматограммы сиквенсов участка СpG-островка гена SLC15A3.

Рисунок 4. Хроматограммы сиквенсов продуктов ПЦР, полученных при амплификации бисульфит-модифицированной ДНК промоторного участка гена SLC15A3 в клеточной линии РПЖ DU-145 и в нормальной ткани предстательной железы (НП). Стрелками отмечено присутствие цитозина (С) в CpG-динуклеотидах в клеточной линии РПЖ и тимина (Т) – в нормальной ткани.

В ходе анализа частоты метилирования гена SLC15A3 в клинических образцах было установлено, что в случае РПЖ ранней стадии частота метилирования составила 70% (14/20), РПЖ поздней стадии – 65% (11/17). В случае ПИН было метилировано 37% образцов (7/19). Такие высокие показатели метилирования в образцах рака предстательной железы различных стадий, как и в случае гена PDLIM4, свидетельствуют о возможности использования данного гена в качестве биологического маркера РПЖ в диагностике заболевания.

Ген TACSTD2. Ген TACSTD2 располагается на первой хромосоме в районе участка р32.1. TACSTD2 представляет собой трансмембранный гликопротеин клеточной поверхности. На данный момент о функциях этого гена известно немногое. Предполагается, что он участвует в регуляции уровня кальция в клетке и выполняет функции рецептора (Ripani et al., 1998). Было обнаружено, что TACSTD2 экспрессируется в больших количествах в активно-растущих тканях, поэтому вероятно он участвует в процессе морфогенеза. Белок TACSTD2 содержит N-термальную сигнальную последовательность, имеющую в своем составе EGF (эпидермальный фактор роста) - подобный и тиреоглобулиновый повторы, а также сайт связывания PIP2 (фосфатидилинозитол-4,5-дифосфат), который в свою очередь, является одним из важнейших липидов клеточной мембраны и принимает участие во многих клеточных процессах, таких как эндо- и экзоцитозы, активация ферментов и вторичных мессенджеров, организация цитоскелета и т.д. (McLaughlin et al., 2005). El Sewedy et al. показали, что сайт связывания PIP2, входящий в состав TACSTD2, способен фосфорилироваться протеинкиназой С, что может иметь определенные последствия при опухолеобразовании (El Sewedy et al., 1998).

В ходе эпигенетической реактивации генома клеточных линий РПЖ значительное повышение уровня экспрессии TACSTD2 было отмечено для клеточной линии LNCaP - в 9,9 раз. Исследуемый CpG-островок длиной 1768 п.н. содержал в себе 173 CpG динуклеотида, состав GC = 64%, H/T = 0,94. Секвенирование участка длиной 366 п.н. показало метилирование в клеточной линии LNCaP, три другие клеточные линии РПЖ и образцы нормальной ПЖ были неметилированы (рис. 5).

Рисунок 5. Хроматограммы сиквенсов продуктов ПЦР, полученных при амплификации бисульфит-модифицированной ДНК промоторного участка гена TACSTD2 в клеточной линии РПЖ LNCaP и в нормальной ткани предстательной железы (НП). Стрелками отмечено присутствие цитозина (С) в CpG-динуклеотидах в клеточной линии РПЖ и тимина (Т) – в нормальной ткани.

Далее был проведен анализ частоты метилирования в клинических образцах. На ранних стадиях РПЖ метилирование было зафиксировано лишь в 10% образцов (2/20); на более поздних стадиях РПЖ частота метилирования составила 23,5% (4/17), при заболевании ПИН ни один образец не был метилирован. Таким образом, можно сделать вывод о небольшом вкладе эпигенетических механизмов в регуляцию экспрессии данного гена. Так, несколько работ по определению уровня экспрессии гена TACSTD2 в опухолевых клетках разной локализации показали гиперэкспрессию данного гена при раке толстого кишечника, яичников, мочевого пузыря и пищевода, причем в последнем случае размер опухоли коррелировал с титром белка TACSTD2 в крови (Alberti et al., 1992, Miotti et al., 1987, Fradet et al., 1984, Nakashima et.al., 2004). Однако, согласно Kim et al, данный ген гиперметилирован в 68% случаях злокачественных глиом (Kim et al., 2006). До сих пор нет сведений об уровне экспрессии TACSTD2 при патологиях предстательной железы. Наши результаты демонстрируют отсутствие метилирования при ПИН, а небольшие показатели метилирования в образцах РПЖ возможно объяснить возрастными причинами: средний возраст пациентов, у которых было зафиксировано метилирование, составлял 60 лет в группе ранней стадии РПЖ и 72 года в группе поздней стадии РПЖ.

Ген GADD45b. Ген GADD45b располагается на участке 19p13.3 и кодирует белок весом 17,8 кДа и длиной 160 а.о. GADD45b принадлежит к группе генов, транскрипция которых повышается в ответ на стресс или воздействие ДНК-разрушающих веществ через активацию p38/JNK сигнального пути. Регуляция данного сигнального пути осуществляется путем связывания и индукции MTK1/MEKK4 киназ, которые, в свою очередь, являются активаторами p38 и JNK МАР–киназ. Таким образом, GADD45b участвует в регуляции процессов клеточного роста, репарации ДНК, клеточной выживаемости и апаптоза (Takekawa et al., 1998; Zhang et al., 1999). Было показано, что мутации в гене p53 могут вызывать снижение экспрессии гена GADD45b (Zhan Q. et al., 1994).

В результате обработки данных microarray анализа было установлено повышение экспрессии гена GADD45b в трех клеточных линиях в среднем в три раза. Анализ промоторного участка показал наличие CpG-островка длиной 1674 п.н., содержащего 145 CpG динуклеотидов. Результаты секвенирования продемонстрировали гиперметилирование в трех клеточных линиях РПЖ LNCaP, MDA 2b, DU-145 (рис. 6).

Рисунок 6. Хроматограммы сиквенса продуктов ПЦР, полученных при амплификации бисульфит-модифицированной ДНК промоторного участка гена GADD45b в клеточной линии РПЖ LNCaP и в нормальной ткани предстательной железы (НП). Стрелками отмечено присутствие цитозина (С) в CpG динуклеотидах в клеточной линии РПЖ и тимина (Т) – в нормальной ткани.

Дальнейшее исследование паттерна метилирования в клинических образцах методом ПЦР в реальном времени показало метилирование только одного образца опухоли простаты поздней стадии. Для подтверждения статуса метилирования, данный образец был просеквенирован (рис. 7).

Рисунок 7. Хроматограмма сиквенса продукта ПЦР, полученного при амплификации образца №2545. Стрелками отмечено наличие цитозина в составе CpG-динуклеотида.

Таким образом, результаты нашего исследования продемонстрировали повышение экспрессии, последовавшее после эпигенетической реактивации генома клеточных линий РПЖ, но результаты анализа клинических образцов показал минимальное значение метилирования при различных патологиях ПЖ.

Ген AQP3. Ген AQP3 располагается на участке хромосомы 9р21.1. Аквапорин 3 (AQP3) представляет собой мембранный белок, принадлежащий семейству аквапоринов, белков водных каналов, благодаря которым осуществляется пассивное перемещение воды по осмотическому градиенту (Agre et al., 1993). К настоящему времени идентифицировано 11 членов данного семейства, которые можно разделить на 2 большие подгруппы. В целом, все аквапорины имеют схожую структуру и распределены между различными тканями организма. Белок аквапорин 3 чаще всего обнаруживается в базолатеральных плазматических мембранах клеток почек, эпидермиса, легких, кишечника и т.д. Хотя аквапорины не являются единственными молекулами, отвечающими за транспорт воды в клетку, предполагается, что они принимают участие в развитии ряда наследственных и приобретенных заболеваний, в том числе таких, как отек мозга, цирроз, сердечная недостаточность, глаукома, различные новообразования. Было показано отсутствие экспрессии гена AQP3 при мелкоклеточной карциноме легкого, плеоморфной карциноме и при метастазировании рака толстого кишечника (Liu et al., 2007).

В ходе нашего исследования в результате ингибирования процесса метилирования было установлено повышение уровня экспрессии гена AQP3 в 3,32-6,55 раз в трех клеточных линиях рака предстательной железы (LNCaP – в 3,32 раза, MDA2b – в 3,82 раза, РС-3 – в 6,55 раза). Исследуемый CpG-островок имел длину 544 п.н. и соответствовал всем критериям CpG-островка (состав GC = 70%, Н/Т = 0,65). Результаты секвенирования показали, что промоторная область гена AQP3 метилирована в клеточных линиях рака предстательной железы LNCaP и MDA2b, в то время как в двух других клеточных линиях и в нормальной ткани метилирование обнаружено не было (рис.8)

Рисунок 8. Рисунок 6. Хроматограммы сиквенса продуктов ПЦР, полученных при амплификации бисульфит-модифицированной ДНК промоторного участка гена AQP3 в клеточной линии РПЖ LNCaP и в нормальной ткани предстательной железы (НП). Стрелками отмечено присутствие цитозина (С) в CpG динуклеотидах в клеточной линии РПЖ и тимина (Т) – в нормальной ткани.

Далее в ходе анализа клинических образцов ПИН и РПЖ различных стадий с помощью методов количественной ПЦР в реальном времени и секвенирования было показано отсутствие локального гиперметилирования при различных патологиях ПЖ (рис. 9).

Рисунок 9. Хроматограммы сиквенса продуктов ПЦР, полученных при амплификации бисульфит-модифицированной ДНК промоторного участка гена AQP3 в клинических образцах РПЖ (а, б) и ПИН (в) Стрелками отмечены наличие тимина в составе CpG-динуклеотида, что означает отсутствие метилирования в образце.

Ген IFI30. IFI30 принадлежит семейству сульфогидрилредуктаз, способных катализировать процесс разрыва дисульфидных связей, преимущественно при нейтральных рН, однако IFI30 является уникальным ферментом, выполняющим свои функции при кислых значениях рН (4,5-5,5) (Arunachalam еt al., 2000). Преимущественно данный белок синтезируется в антиген-представляющих клетках, но при этом обнаруживается во многих типах клеток. Его экспрессия индуцируется при действии таких цитокинов как интерферон-, интерлейкин 1 и др. IFI30 играет ключевую роль в денатурации антигенов, предшествующей протеолизу и презентации фрагментов главным комплексом гистосовместимости II (Phan et al., 2000). Было продемонстрировано, что при различных меланомах уровень экспрессии гена IFI30 либо полностью прекращается, либо снижается до минимальных значений (Haque et al., 2002)

В результате microarray анализа было показано, что уровень экспрессии в клеточных линиях РПЖ LNCaP, PC-3, DU-145, MDA2b возрос в 5,2; 4; 2 и 3 раза соответственно. Исследованный CpG-островок находится в первом экзоне и имеет длину 353 п.н. GC состав = 67%, Н/Т = 0, 58. В результате секвенирования участка промотора длиной 279 п.н. было продемонстрировано метилирование в клеточных линиях LNCaP и PC-3 (рис. 10).

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»