WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |

На первом этапе клетки клеточных линий РПЖ LNCaP, DU-145, PC-3 и MDA2b инкубировались в присутствии 5-аза-2-деоксицитидина (5 мкМ/л) и трихостатина А (500 нМ/л). Клетки контрольной группы инкубировались с эквивалентным количеством PBS и этанола. Из двух групп клеток, экспериментальной и контрольной, выделяли РНК, с последующим проведением реакции обратной транскрипции. Далее полученную кДНК метили с использованием флуоресцентных меток - производных индокарбоксицианина Су3 и индодикарбоксицианина Су5, и проводили реакцию гибридизации с ДНК чипом (MWG Biotech, Inc., High Point, USA), с иммобилизованными на нем 15 тыс. ДНК-зондами. Процесс гибридизации повторяли дважды с использованием метода flip-dye, при котором производилась взаимная замена использованных флуоресцентных меток. Одновременная детекция обоих сигналов в каждой из ячеек позволяет прямо сравнить их интенсивность и избежать ошибок, связанных с неполной воспроизводимостью результатов.

В ходе анализа результатов, полученных при двукратном повторении процесса гибридизации (рис. 1), были получены следующие данные. В клеточной линии РПЖ LNCaP двукратное увеличение экспрессии было зафиксировано в 663-х генах; в клеточной линии MDA2b – в 366 генах; в клеточной линии DU-145 – в 293-х генах; в клеточной линии РС-3 – в 641-м гене.

Рисунок 1. Результат сканирования слайда, полученного в результате гибридизации кДНК и ДНК чипа. Ячейки красного цвета соответствуют генам, экспрессия которых повысилась в результате ингибирования процесса метилирования ДНК. Ячейки зеленого цвета – генам с пониженной экспрессией. Ячейки желтого цвета – гены, экспрессия которых не изменилась.

Анализ экспрессии генов в клетках морфологически нормальной предстательной железы.

Для дальнейших исследований были отобраны 170 генов, экспрессия которых повысилась как минимум в три раза в трех из четырех клеточных линиях РПЖ. Далее был проведен сравнительный анализ уровня экспрессии идентифицированных генов в клетках морфологически нормальной ПЖ и ПЖ, пораженной раком. Используя базу данных Cancer Genome Anatomy Project (CGAP), где представлены результаты исследований уровней экспрессии генов в различных органах, как в норме, так и при раковой патологии (http://cgap.nci.nih.gov), мы проанализировали экспрессию каждого гена в клетках нормальной ПЖ и ПЖ, пораженной раком. Отсутствие экспрессии в клетках морфологически нормальной ПЖ было показано для 103-х генов.

Анализ CpG-островков.

При анализе CpG-островков использовались три основных критерия: распределение CpG динуклеотидов по нуклеотидной последовательности, GC состав и длина последовательности.

Так, для оценки распределения CpG динуклеотидов вычисляется показатель Н/Т по следующей формуле:

где Н - наблюдаемое число CpG динуклеотидов; Т – теоретическое число CpG динуклеотидов; n – число CpG в последовательности; N – общее число нуклеотидов в последовательности; NС – число остатков цитозинов; NG - число остатков гуанина. Для CpG-островка этот показатель должен быть 0,6. GC состав - доля цитозиновых и гуаниновых нуклеотидов в составе последовательности для CpG-островка должна быть не меньше 55%. Длина CpG-островка варьирует от 200 п.н. до несколько тысяч, составляя в среднем 1000 п.н. (Gardiner-Garden et al., 1987).

Данные условия отбора также способствуют исключению большинства Alu-повторяющихся элементов, которые могут входить в состав промоторов некоторых кодирующих белков генома человека и перекрываться с CpG-островками и цис-регуляторными модулями, представляющими собой кластеры сайтов связывания транскрипционных факторов, тем самым, влияя на экспрессию генов (Oei et al., 2004). Дополнительно с той же целью была использована компьютерная программа обнаружения повторов Repeat Masker (www.repeatmasker.org).

При анализе нуклеотидных последовательностей промоторов исследуемых генов на наличие CpG-островков в их составе использовалась компьютерная программа Webgene CpG island prediction (www.itb.cnr.it/sun/webgene/).

В результате анализа было установлено, что 16 генов не имеют в своем составе CpG островков; гены TLH29, APOD и CRYAB имеют в составе промоторов CpG-островки, не удовлетворяющие критериям отбора; ген TIMP1 располагается на Х хромосоме; ген IGF2R является импринтированным, а ген JUNB - онкогеном. Анализ литературы показал, что 20 генов ранее были изучены и результаты исследований опубликованы.

Таким образом, для дальнейшей работы были отобраны 25 генов (табл. 1), большинство из которых представляют собой гены, кодирующие транскрипционные факторы, а также рецепторы, белки-переносчики, белки цитоскелета и иммунного ответа.

Таблица 1. Хромосомная локализация и краткая характеристика отобранных генов.

Ген

Хромосомная локализация

Функция гена

1

H1F2

6p22.2

Конденсация нуклеосом

2

TBX1C

22q11.21

Транскрипционный фактор

3

ID1

20q11.21

Негативная регуляция транскрипции

4

GNAI3

17q24.1

Связывание нуклеотидов

5

RELB

19q13.32

Транскрипционный фактор

6

BASP1

5q15.1

Связывание ДНК в клетках НС

7

FOSL2

2p23.2

Транскрипционный фактор

8

IRF6

1q32.2

Транскрипционный фактор

9

GADD45b

9q22.2

Регуляция клеточных процессов

10

CTSD

11p15.5

Протеолиз

11

IFI30

19p13.11

Иммунный ответ

12

DAF

1q32.2

Активация комплиментов

13

FXYD5

19q13.12

Клеточная адгезия

14

KRT7

12q13.13

Организация цитоскелета и биогенез

15

PDLIM4

5q23.3

Организация цитоскелета

16

TACSTD2

1p32.1

Рецептор, регулятор уровня Са2+

17

ANXA2

15q22.2

Связывание иона кальция

18

ITGA3

17q21.33

Рецептор

19

ECGF1

22q13.33

Фактор роста

20

ARL6IP

16p12.3

Транспорт белков, клеточный сигналинг

21

AQP3

9p13.3

Транспорт белков, клеточный сигналинг

22

SLC15A3

11q12.2

Транспорт белков

23

ARL7

2q37.1

Связывание ГТФ и ГДФ

24

ACAA2

18q21.1

Ацетил-КоА-ацилтрансферазная активность

25

ASNS

7q21.3

Аспартатная и аспарагиновая активность

Определение статуса метилирования CpG-островков отобранных генов в клеточных линиях РПЖ и морфологически нормальной ткани ПЖ.

Для определения статуса метилирования CpG-островков отобранных генов в клеточных линиях РПЖ и морфологически нормальной ткани ПЖ были использованы методы бисульфитной модификации ДНК и секвенирования. При обработке ДНК бисульфитом натрия все неметилированные цитозины конвертируются в урацил, в то время как метилированные цитозины в составе CpG динуклеотидов остаются неизменными. В дальнейшем при амплификации исследуемого участка ДНК все остатки урацила и тимина амплифицируются как тимин и только 5-метилцитозин воспроизводится как цитозин.

В результате секвенирования промоторных участков двадцати пяти генов было установлено, что CpG-островки генов ANXA2, AQP3, IFI30, KRT7, PDLIM4, TACSTD2, SLC15A3, GADD45b метилированы в клеточных линиях РПЖ, но неметелированы в морфологически нормальной ткани ПЖ. Ген BASP1 метилирован и при патологии и в норме. Это связано, видимо, с тем, что продукт данного гена представляет собой белок аксонных окончаний нейронов и главным образом синтезируется в клетках нервной системы, т.е. ген BASP1 является тканеспецифическим геном, что и объясняет его метилированное состояние в морфологически нормальной ткане ПЖ. Результаты секвенирования остальных генов показали отсутствие метилирования и в клеточных линиях РПЖ и в морфологически нормальной ткани ПЖ (табл. 2).

Таблица 2. Статус метилирования CpG-островков в клеточных линиях РПЖ и морфологически нормальной ткани ПЖ.

 

Ген

LNCaP

DU-145

MDA2b

PC-3

HП1

HП2

HП3

1

H1F2

-

-

-

-

-

-

-

2

TACSTD2

+

-

-

-

-

-

-

3

IFI30

+

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»