WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Направленную амплификацию фрагментов ДНК M. gallisepticum S6 посредством ПЦР проводили с использованием праймеров, синтезированных на основе известных нуклеотидных последовательностей генов (himA/hup, pvpA, rpoD, recA, dnaB) M. gallisepticum Rlow [Papazisi et al., 2003]. Олигонуклеотиды синтезировали в НПО "ЛИТЕХ" (г. Москва). Анализ продуктов ПЦР проводили с помощью электрофоретического разделения фрагментов ДНК в 2% агарозном геле ("Helicon", Россия) с последующим окрашиванием бромистым этидием (10 мг/мл).

Клонирование фрагментов ДНК M. gallisepticum S6 в плазмиде pGEM-T Easy Vector ("Promega", США) осуществляли согласно инструкции изготовителя. Трансформацию проводили с помощью электропорации в ампициллин-резистентный штамм E. coli DH5.

Секвенирование фрагментов ДНК осуществляли с помощью автоматического секвенатора ABI 3130 ("Applied Biosystems", США), согласно инструкции изготовителя на базе лаборатории протеомного анализа ФГУ НИИ физико-химической медицины Минздрава РФ (г. Москва).

Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей проводили с использованием пакетов программ Informax Vector NTI Suite 9 и DNAMAN 4.0. Поиск доменов проводили в BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi), SwissProt (http://cn.expasy.org/), BLOCKs (http://blocks.fhcrc.org/), Prosite (http://cn.expasy.org/prosite/), Pfam (http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/), SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/).

Подготовку препаратов, двумерный электрофорез и идентификацию белков проводили по Говоруну и др. [2003], Blum et al. [1987] и Grg et al. [2000] на базе лаборатории протеомного анализа ФГУ НИИ физико-химической медицины Минздрава РФ (г. Москва).

Белки, выделенные из ВФ и НФ клеток M. gallisepticum S6, составляли контрольную и опытную группы, соответственно. Белки идентифицировали по массам протеолитических фрагментов с использованием программы Mascott Peptide Fingerprint (Matrix Science, США) и базы данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank), содержащей полную последовательность генома M. gallisepticum Rlow [Papazisi et al., 2003].

Инфицирование растений (Vinca minor L. и Vigna radiata L.) клетками М. gallisepticum S6 проводили по Чернову и др. [2007] спонтанным заражением 3-х дневных проростков растений через корневую систему посредством инкубирования корешков растений в течение 24 часов в растворах фосфатно-солевого буфера, содержащих и не содержащих клетки М. gallisepticum S6, для опытных и контрольных растений, соответственно.

Статистический анализ данных проводили с применением стандартных математических методов расчета среднеквадратичного отклонения и сравнения средних по критерию Стъюдента в программе Microsoft Excel 2002. Критерий вероятности P<0,05 принимали достаточным для достоверной разницы опытной и контрольной групп данных [Лакин, 1990].

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

2.1. Особенности морфологии, ультраструктуры и пролиферации клеток M. gallisepticum S6, образующихся в разных условиях культивирования

В результате сравнительного анализа трансмиссивных микрографий было обнаружено, что морфология и ультраструктура клеток M. gallisepticum S6, образующихся в разных условиях культивирования, различаются. На полноценной питательной среде Эдварда (ППСЭ) M. gallisepticum S6 образует грушевидные клетки (длина 0,6-1 мкм), которые имеют четкие цитоскелетоподобные образования и терминальную структуру "bleb". Эти клетки образуют на твердых питательных средах характерные колонии ("fried eggs") и соответствуют типичным вегетативным (пролиферирующим) формам (ВФ) клеток микоплазмы.

Рис. 1. Трансмиссивные микрографии ВФ (А) и НФ (Б) клеток M. gallisepticum S6

Т – тубулиноподобные структуры, В – терминальная структура "bleb", М – клеточная мембрана, КПС – капсулоподобная структура.

На среде с ограничением субстрата и при понижении температуры культивирования M. gallisepticum S6 образует кокковидные клетки (диаметр 0,2-0,8 мкм), лишенные полярных образований. Такие клетки имеют конденсированный нуклеоид и электронно-плотную структуру мембран. Цитоскелетоподобные структуры в кокковидных клетках M. gallisepticum S6 не визуализируются. При этом некоторые клетки оказываются окруженными капсулоподобными образованиями (рис. 1Б).

На основании данных МПР и определения КОЕ было установлено, что клетки M. gallisepticum S6 при статическом культивировании на ППСЭ и в НУ теряют способность к пролиферации и образованию колоний через 15 и 8 суток, соответственно. Однако, по данным ПЦР, а также цитохимических методов и электронной микроскопии, интактность ДНК M. gallisepticum S6, а также целостность мембраны клеток микоплазмы при культивировании их в НУ сохраняются на протяжении всего срока наблюдения (180 суток). При этом было обнаружено, что при увеличении срока статического культивирования клеток микоплазмы в НУ происходит уменьшение клеточных размеров и исчезновение класса клеток с линейными размерами 0,8-1 мкм (рис. 2). Подобные уменьшения размера клеток характерны для аспорогенных бактерий, в том числе A. laidlawii PG8, при адаптации бактерий к НУ среды, связанной с переходом ВФ клеток в НФ [Головлев, 1998; Чернов и др., 2005].

Рис. 2. Изменение основных модальных классов клеток M. gallisepticum S6, при культивировании в разных условиях – на ППСЭ (А) и в НУ в течение 3 (Б), 12 (В), 16 (Г) и 20 (Д) недель

По оси ординат – среднее значение длины клеток (нм) ± стандартное отклонение

Полученные нами данные позволяют заключить, что адаптация M. gallisepticum S6 к НУ среды, как и ряда аспорогенных бактерий, в том числе A.  laidlawii PG8, связана с переходом ВФ микоплазмы в НФ. Однако, по данным Чернова с соавт. (2005), клетки A.  laidlawii PG8 на ППСЭ теряют способность к образованию колоний через 21 сутки, а в НУ среды у части (менее 0,1 %) популяции клеток микоплазмы способность формировать колонии сохраняется на протяжении 380 суток. При этом преобладающим классом популяции адаптированных к НУ среды клеток A. laidlawii PG8 является класс кокковидных клеток размером 0,2 мкм и менее (наноклетки и наноформы). Между тем появление клеток размером 0,2 мкм и менее связывают с промежуточной стадией формирования НС у бактерий [Kaprelyants et al., 1993]. В наших исследованиях такой класс клеток M. gallisepticum S6 появлялся на 16 неделе культивирования микоплазмы в НУ среды, составлял только 19% клеточной популяции и исчезал к 20 неделе статического культивирования бактерий в соответствующих условиях. Полученные нами данные могут свидетельствовать о существенных различиях реактивности клеточных популяций A. laidlawii PG8 и M. gallisepticum S6 в отношении соответствующих условий среды.

Применение метода "пробуждения" НФ клеток A. laidlawii PG8 оказался неэффективным для реверсии НФ M. gallisepticum S6 – превращение НФ в типичные ВФ клеток микоплазмы. Известно, что условия пробуждения из некультивируемого в активно пролиферирующее состояние у различных бактерий весьма различаются [Головлев, 1998]. Для НФ некоторых бактерий единственным эффективным способом реверсии является пассаж через восприимчивый организм [Романова, Гинцбург, 1998]. Вероятно, реверсия M. gallisepticum S6 требует специфичных факторов, которые еще предстоит определить.

2.2. Особенности амплификации нуклеотидных последовательностей ряда генов клеток M. gallisepticum S6, образующихся в разных условиях культивирования

Изменения топологии ДНК бактерий в НУ, ассоциированные в том числе с конденсацией нуклеоида, могут приводить к дифференциальной амплификации нуклеотидных последовательностей некоторых генов клеток микроорганизмов, образующихся в соответствующих условиях среды [Warner, Oliver, 1998]. Этот эффект может вызываться ДНК-связанными белками и проявляться аттенуацией ПЦР-сигнала при использовании матричной ДНК без специальной очистки [Зигангирова и др., 1995].

В наших исследованиях дифференциальная амплификация была установлена при использовании в ПЦР специфичных праймеров для амплификации полной нуклеотидной последовательности pvpA-гена микоплазмы (рис. 3). Этот эффект был связан, в частности, с появлением у НФ M. gallisepticum S6 дополнительного ампликона (рис. 3, дор. 4). Специфичные

Рис. 3. Электрофореграмма продуктов амплификации нуклеотидных последовательностей ДНК ВФ (1, 2), НФ (3, 4), а также адаптированных клеток M. gallisepticum S6 при отмене НУ (5), обработанных (2, 4) и необработанных (1, 3, 5) протеиназой K, М – маркер длины фрагментов.

праймеры для амплификации нуклеотидной последовательности гена pvpA M. gallisepticum S6 позволяют определять с помощью ПЦР в тестируемых образцах клетки микоплазмы, образующиеся в разных условиях, – ВФ и НФ.

Образование дополнительного ПЦР-продукта размером 582 н.п.о. при амплификации ДНК НФ M. gallisepticum S6 и клеток адаптированной культуры при отмене НУ может свидетельствовать как о появлении дополнительных сайтов отжига праймеров, так и рекомбинационных процессах, связанных с нуклеотидной последовательностью гена pvpA, при культивировании клеток микоплазмы в новых условиях. PvpA M. gallisepticum является фазовариабельным белком цитоадгезии, подверженным высокочастотным перестройкам [Boguslavsky et al., 2000]. Вариабельность антигенных детерминант белков клеточной поверхности является способом преодоления микоплазмами иммунного контроля организма-хозяина [Yogev et al., 2002]. Вариации обусловливаются структурными перестройками генов соответствующих белков. Такие данные были получены нами в отношении vaa-генов клинических изолятов M. hominis при сравнительном анализе их нуклеотидных последовательностей [Chernov et al., 2005].

В этой связи нами были определены первичные нуклеотидные последовательности основных и дополнительных ампликонов, возникающих при использовании в ПЦР ДНК клеток M. gallisepticum S6, образующихся в разных условиях (рис. 4). В нуклеотидных последовательностях основных

Рис. 4. Ампликоны ДНК клеток M. gallisepticum S6, образующихся в разных условиях, полученные в ПЦР с праймерами для амплификации pvpA-гена микоплазмы (А) и нуклеотидные последовательности соответствующих ПЦР-продуктов (Б, В, Г).

На электрофореграмме представлены ампликоны ВФ (1), НФ (2,3), образующихся при статическом культивировании в НУ в течение 8 и 20 недель, соответственно, и адаптированных клеток микоплазмы при отмене НУ (4).

pvpA-ампликонов размером 1150 н.п.о. ВФ и НФ M. gallisepticum S6 была выявлена ОРС размером 1086 н.п.о., которая на 97% оказалась гомологичной нуклеотидным последовательностям pvpA-генов штаммов R и Pendik M. gallisepticum. Первичная структура гена pvpA клеток M. gallisepticum S6, образующихся в разных условиях культивирования (ВФ и НФ), оказалась идентичной.

В нуклеотидной последовательности дополнительного ампликона (582 н.п.о.), возникающего у НФ микоплазмы, были выявлены две ОРС, не зарегистрированные в геноме ВФ M. gallisepticum Rlow. Высокая степень гомологии нуклеотидной последовательности соответствующего ампликона с геном pvpA (54%) при отсутствии других протяженных гомологичных участков на хромосоме M. gallisepticum R позволяет предполагать, что pvpA-ген может быть основой для формирования новых участков в геноме микоплазмы.

В литературе имеются данные, что адаптация организмов (про- и эукариот) к новым условиям окружающей среды может быть связана с внутригеномными рекомбинационными перестройками, определяющими образование новых нуклеотидных последовательностей, а также генов [Гогвадзе, Буздин, 2005; Гогвадзе и др., 2005; Torkelson et al., 1997; Esnault et al., 2000]. Однако молекулярные механизмы соответствующего явления у M. gallisepticum S6 еще предстоит выяснить.

2.3. Сравнительный анализ полипептидов клеток M. gallisepticum S6, образующихся в разных условиях культивирования

В результате сравнительного анализа полипептидов клеток M. gallisepticum S6, образующихся в разных условиях культивирования, было установлено, что адаптация M. gallisepticum S6 к НУ сопровождается существенным изменением экспрессии белков в клетках микоплазмы (табл. 1). Количественный и качественный состав полипептидных пулов ВФ и НФ M. gallisepticum S6 весьма различается. Различия связаны как с редукцией, так и индукцией экспрессии продуктов ряда генов, а также появлением в клетках НФ микоплазмы изоформ белков. У НФ микоплазмы наблюдается тенденция к смещению значительного количества белков в кислую область.

Всего в результате сравнительного анализа полипептидных спектров ВФ и НФ M. gallisepticum S6 было идентифицировано 63 белка, участвующие в адаптации клеток микоплазмы к НУ.

Образование изоферментов, участвующих в энергетическом метаболизме в НФ клеток, может способствовать оптимизации катализа реакций в клетках бактерий в НУ среды [Хочачка, Сомеро, 1988]. При этом чрезвычайно высокое в НФ M. gallisepticum S6 разнообразие изоформ адгезинов (в том числе PvpA), отличающихся не только по рН, но и по массе, может быть универсальной защитной реакцией микоплазм, связанной с усилением адгезии бактерий к клеткам хозяина под действием стрессовых факторов [Wasinger et al., 2000].

Полученные нами данные свидетельствовали, что в НФ клеток M. gallisepticum S6 сохраняется значительная часть ферментов гликолитического пути. При этом наличие изоформ соответствующих ферментов позволяет предполагать, что одним из путей, активирующихся в клетках M. gallisepticum S6 при культивировании их в НУ среды, является

Табл. 1.

Идентифицированные белки, экспрессия которых значительно изменяется при адаптации M. gallisepticum S6 к НУ

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»