WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 |

На правах рукописи

МУЗЫКАНТОВ Алексей Александрович

АДАПТАЦИЯ МИКОПЛАЗМ (MYCOPLASMA GALLISEPTICUM S6)

К НЕБЛАГОПРИЯТНЫМ УСЛОВИЯМ

03.00.04 - биохимия

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Казань-2008

Работа выполнена в лаборатории молекулярных основ патогенеза Казанского института биохимии и биофизики Казанского научного центра Российской академии наук

Научный руководитель: доктор биологических наук

Чернова Ольга Александровна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Мелентьев Александр Иванович

(Институт биологии РАН, г.Уфа)

кандидат биологических наук, доцент

Гимадутдинов Олег Александрович

(Казанский Государственный Университет им. Ульянова-Ленина, г.Казань)

Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н.Баха

РАН, г.Москва

Защита состоится "__" октября 2008 года в "____" часов на заседании диссертационного совета Д 212.081.08 при Казанском государственном университете им. В.И. Ульянова-Ленина по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, д. 18, главное здание, ауд. 211.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Н.И. Лобачевского Казанского государственного университета.

Автореферат разослан "___" сентября 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук Абрамова З.И.

Актуальность проблемы. Выяснение механизмов, обеспечивающих выживание микоплазм (класс Mollicutes) в разных условиях среды, представляет значительный интерес как с точки зрения фундаментальных исследований, так и практических разработок, связанных с определением молекулярных основ формирования и эволюции системы "паразит-хозяин" и способов её контроля [Борхсениус и др., 2002; Razin et al., 2006].

Большой объем экспериментальных и теоретических данных, полученных в разных лабораториях мира за последние годы, значительно расширил представления о биологии мельчайших бесстеночных бактерий, способных к самостоятельному воспроизведению. Однако в исследовании адаптации этих бактерий к биогенным и абиогенным стрессорам сделаны лишь первые шаги [Чернов и др., 2005, 2007; Cecchini et al., 2007]. Было обнаружено, что адаптация "вездесущей" микоплазмы Acholeplasma laidlawii к неблагоприятным условиям (ограничению по субстрату и понижение температуры) связана с превращением вегетативных форм (ВФ) клеток микоплазмы в некультивируемые формы (НФ) и показано, что ВФ и НФ A. laidlawii существенно различаются по морфологии, ультраструктуре, экспрессии генома и патогенности [Чернов и др., 2004; Chernov et al., 2007]. Изменения размеров, морфологии, ультраструктуры, пролиферации и вирулентности клеток, возникающих при неблагоприятных условиях роста у аспорогенных бактерий, описаны в ряде работ [Головлев и др., 1998; Вайнштейн, Кудряшова, 2000; Oliver, 2005]. Однако соответствующие процессы у разных видов микоплазм не изучены.

Уникальным видом микоплазм с точки зрения адаптивных способностей является Mycoplasma gallisepticum. Эта микоплазма, известная как возбудитель болезней птиц и контаминант создаваемых на основе куриных эмбрионов вирусных вакцин, встречается также у растений [Коромыслов и др., 1987; McGarrity et al., 1992]. Контроль и подавление инфекций, вызываемых M. gallisepticum, представляют серьезную проблему, решение которой связывают с успехами изучения молекулярной и клеточной биологии микоплазмы, определяющей адаптацию бактерий к неблагоприятным условиям (НУ) среды и патогенность.

Цель данной работы - выяснить особенности адаптации M. gallisepticum S6 к неблагоприятным условиям среды.

Основные задачи исследования:

  1. Провести сравнительный анализ морфологии, ультраструктуры и пролиферации клеток M. gallisepticum S6, образующихся на полноценной питательной среде и в неблагоприятных условиях (ограничение по субстрату и понижение температуры) культивирования.
  2. Провести сравнительный анализ амплификации нуклеотидных последовательностей ряда генов клеток M. gallisepticum S6, образующихся в разных условиях культивирования.
  3. Провести сравнительный анализ полипептидов клеток M. gallisepticum S6, образующихся в разных условиях культивирования.
  4. Провести сравнительный анализ ДНК-повреждающего действия клеток M. gallisepticum S6, образующихся в разных условиях культивирования.
  5. Провести сравнительный анализ фитопатогенности клеток M. gallisepticum S6, образующихся в разных условиях культивирования.

Научная новизна. Впервые установлено, что адаптация M. gallisepticum S6 к НУ сопровождается переходом ВФ клеток микоплазмы в НФ. ВФ и НФ M. gallisepticum S6 существенно различаются по морфологии и ультраструктуре.

Впервые показано, что ВФ клеток M. gallisepticum S6 проявляют генотоксичность в отношении тестерного штамма E. coli PQ37, тогда как НФ микоплазмы в отношении соответствующего штамма бактерии ДНК- повреждающего действия не оказывают.

Впервые определена полная нуклеотидная последовательность гена pvpA, кодирующего фазовариабельный белок цитоадгезии M. gallisepticum S6, у ВФ и НФ микоплазмы.

Впервые показано, что переход ВФ в НФ M. gallisepticum S6 связан с изменением топологии, структуры ДНК и экспрессии белков в клетках микоплазмы. Идентифицировано 63 белка, участвующие в адаптации M. gallisepticum S6 к НУ и составлена схема возможных изменений метаболических путей в клетках микоплазмы при культивировании их в НУ среды.

Впервые установлено, что M. gallisepticum S6 обладает фитопатогенным потенциалом и показано, что адаптация к НУ сопровождается изменением вирулентных свойств микоплазмы.

Научно-практическая значимость. Полученные данные вносят вклад в понимание адаптации M. gallisepticum S6 к неблагоприятным условиям среды. Результаты работы могут служить основой для развития новых подходов к определению молекулярных механизмов формирования и эволюции системы "паразит-хозяин", а также способов контроля микоплазменных инфекций.

Разработаны методы исследования процесса адаптации к НУ среды M. gallisepticum S6 in vitro. Предложен молекулярно-генетический зонд для дифференциальной диагностики ВФ и НФ M. gallisepticum S6 – высокопатогенной для птиц микоплазмы, являющейся контаминантом создаваемых на основе куриных эмбрионов вирусных вакцин, способной также инфицировать растения.

Экспериментальные данные и методические приемы, изложенные в работе, могут быть использованы в медицинских, ветеринарных, сельскохозяйственных, биологических и биотехнологических учреждениях, занимающихся разработкой способов диагностики и контроля микоплазменных инфекций, а также в учебном процессе, в том числе курсах лекций по биохимии, молекулярной биологии, микробиологии, стрессологии и физиологии растений в ВУЗах.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследование. Работа в 2005-2008 гг. проводилась в соответствии с планом научных исследований КИББ КазНЦ РАН по теме "Взаимодействие микоплазм с высшими организмами на молекулярно-генетическом уровне" (№ гос. рег. 0120.0 603845). Исследования автора, как исполнителя данной темы, поддержаны грантами ГК № 02.512.11.2067 в рамках ФЦП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России" на 2007-2012 годы по приоритетным направлениям "Живые системы" по теме "Сравнительный протеомный анализ вегетативных форм и наноклеток Mycoplasma gallisepticum для создания технологии контроля микоплазменных инфекций" и РФФИ 08-04-01047-а "Молекулярные основы адаптации микоплазм (M. gallisepticum) к биогенным и абиогенным стрессорам: белки наноформ и их гены", 2008-2010 гг., а также грантами ведущей научной школы (руководитель акад. И.А. Тарчевский) № НШ-6042; № НШ-5399,2008,4. Научные положения диссертации и выводы базируются на результатах собственных исследований автора. Синтез праймеров, секвенирование нуклеотидных последовательностей, двумерный электрофорез и идентификацию полипептидов проводили на базе ФГУ НИИ физико-химической медицины Минздрава РФ; оценку генотоксичности клеток M. gallisepticum S6 и наноскопию молекул ДНК – на базе КГУ (биолого-почвенный факультет, кафедра микробиологии и физический факультет, кафедра оптики и нанофотоники, соответственно).

Благодарности: Приношу глубокую благодарность научному руководителю д.б.н. О.А. Черновой за неоценимую помощь в выборе данного направления исследований, за внимательное и оперативное решение проблем, возникавших по ходу выполнения и написания диссертации, за постоянную заботу и поддержку; приношу искреннюю благодарность д.б.н., проф. В.М. Чернову заведующему лабораторией молекулярных основ патогенеза КИББ КазНЦ РАН и к.б.н. О.В. Горшкову за неоценимую помощь в выполнении исследований; выражаю искреннюю благодарность к.б.н. М.В. Трушину, к.б.н. Г.Ф. Шаймардановой, к.б.н. Т.Н. Нестеровой, к.б.н. А.А. Пономаревой КИББ КазНЦ РАН за всестороннюю помощь в проведении работ и анализе полученных данных; выражаю искреннюю благодарность д.б.н., проф. О.Н. Ильинской, к.б.н. А.Б. Маргулис, асп. А.Д. Пельникевич КГУ, а также д.б.н., проф. В.М. Говоруну, к.б.н. В.Н. Лазареву, к.б.н. И.А. Деминой, к.х.н. Т.А. Акопиан, асп. Ю.И. Басовскому ФГУ НИИ физико-химической медицины Минздрава РФ за предоставленные возможности проведения совместных работ и ценные советы при обсуждении результатов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Клетки M. gallisepticum S6, выращенные на полноценной питательной среде и в неблагоприятных условиях – при ограничении субстрата и понижении температуры, - имеют существенные различия по морфологии и ультраструктуре. Длительное культивирование M. gallisepticum S6 в неблагоприятных условиях приводит к превращению вегетативных форм (ВФ) клеток микоплазмы в некультивируемые формы (НФ).

2. Переход ВФ в НФ M. gallisepticum S6 связан с изменением топологии и структуры ДНК микоплазмы.

3. ВФ и НФ клеток M. gallisepticum S6 различаются по экспрессированным белкам.

4. Клетки M. gallisepticum S6 проявляют фитопатогенность в отношении специфичного и неспецифичного индикаторов фитомикоплазмозов.

5. Адаптация M. gallisepticum S6 к НУ сопровождается изменениями генотоксичности, а также фитопатогенности микоплазмы.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены на 11-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология – наука XXI века" (Пущино, 2007), XII Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 150-летию со дня рождения В.М. Бехтерева (Казань, 2007), Всероссийской конференции "Фундаментальные аспекты исследования симбиотических систем" (Саратов, 2007), Итоговой конференции Казанского института биохимии и биофизики КазНЦ РАН (Казань, 2007), Итоговой конференции в рамках приоритетного направления "Живые системы" (Москва, 2007), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), I Всероссийском, с международным участием, конгрессе студентов и аспирантов - биологов "Симбиоз - Россия - 2008" (Казань, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 научных работ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 164 страницах машинописного текста; состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка использованной литературы. В работе представлено 9 таблиц и 24 рисунка. Список цитируемой литературы содержит 286 источников, из них 72 – в отечественных изданиях.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Материалы и методы исследований

В работе был использован штамм Mycoplasma gallisepticum S6, полученный из коллекции микроорганизмов Института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи (РАМН, Москва). Культуру клеток M. gallisepticum S6 после музейного хранения выращивали при 37 С в жидкой питательной среде Эдварда, с модификациями [Борхсениус и др., 2002].

Для получения культуры M. gallisepticum S6, адаптированной к неблагоприятным условиям, и реверсии использовали методы индукции некультивируемого состояния у A. laidlawii PG8 и пробуждения клеток ахолеплазмы из некультивируемого состояния в активно пролиферирующую культуру [Чернов и др., 2004, 2005], соответственно.

Оценку числа жизнеспособных клеток в популяции M. gallisepticum S6 проводили путем подсчета количества колониеобразующих единиц (КОЕ) в 0,3% агаризованной питательной среде (метод Коха) и методом предельных разведений (МПР) в жидкой питательной среде [Пименова и др., 1983], с учетом особенностей культивирования микоплазмы [Борхсениус и др., 2002].

Целостность плазматической мембраны клеток M. gallisepticum S6 определяли по ее проницаемости для красителей: метиленового синего и бромистого этидия [Ильинская и др., 2006]. Препараты анализировали на конфокальном микроскопе LSM 510 META ("Carl Zeiss", ФРГ). Наблюдения проводили в 5 полях зрения для каждого образца.

Трансмиссивную электронную микроскопию проводили согласно Cole [1983]. Ультратонкие срезы получали на микротоме LKB-III (Швеция). Образцы просматривали на электронном микроскопе JEM-1200EX (Япония).

Выяснение токсичных и генотоксичных эффектов клеток M. gallisepticum S6 и их культуральной жидкости проводили по Quillardet et al. [1982].

Выделение ДНК из клеток микоплазм и тканей растений осуществляли с помощью метода фенольной экстракции [Маниатис и др., 1984]. Дополнительно препараты ДНК обрабатывали РНКазой ("Serva", ФРГ) и протеиназой К ("Sigma", США).

Атомно-силовую микроскопию образцов ДНК M. gallisepticum S6 проводили по Braga, Ricci [2004]. Исследование образцов ДНК проводили на атомно-силовом микроскопе Solver P47H ("НТ-МДТ", Россия). Для обработки данных использовали программу Nova 1.0.26 RC1 (разработчик - НТ-МДТ, Россия).

Pages:     || 2 | 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»