WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |   ...   | 13 |

к

0,4410-6

9,3710-4

4,01

н

CoL2

1,510-3

2,2010-6

7,8910-4

13,73

н

1,6810-6

1,4010-3

13,1

с

NiL2

2,010-3

1,8010-6

1,2310-3

12,36

н

1,110-6

3,1110-3

11,7

н

FeL2

1,110-3

8,9710-3

1,13

к

1,5410-6

2,2010-3

11,7

н

MoL2

8,510-4

19,710-3

0,13

к

47,6210-3

0,41

к

Cu(ас)2

3,3·10-5

1,1·10-6

3,92

1,15

с

13,19

0,67

к

Mo(ам)

3,3·10-4

1,39·10-6

3,03

8,83

с

6,60

4,40

к

Mn(ас)2

1,3·10-6

9,66·10-7

1,15

0,014

б

8,80

0,02

к

Fe(ас)2

3,3·10-4

2,75·10-6

4,55

14,23

к

4,40

4,13

к

Ni(ас)2

3,3·10-5

7,66·10-7

3,17

0,88

с

14,66

0,70

к

В отношенииингибирования по акцептору электронов:кузагард, тачигарен, сетоксидим, тилт,MgL2, МоL2 могут быть отнесены кконкурентным ингибиторам. Зенкор, лонтрел,базагран, раундап проявилибесконкурентное ингибирование редуктазы.Можно допустить, что ингибитор и акцепторэлектронов связываются с разными местами вактивном центре фермента.

В отличие от пестицидов,у металлокомплексов лонтрела встречаетсясмешанное ингибирование по акцепторуэлектронов: ZnL2,СоL2, MnL2. Возможно, образуетсякомплекс фермент-ингибитор, к которомуприсоединяется субстрат. КомплексыNiL2, СuL2, FeL2 проявили себя какнеконкурентные ингибиторы НАДН-ОР по НТ.Данный тип ингибирования наблюдается приаллостерическом присоединении ингибитора,которое снижает активность фермента, а неего сродство к субстрату. При этом можетпроисходить присоединение функциональныхгрупп субстрата и ингибитора к различнымместам активного центра фермента.

Рис.6. Зависимость ингиброванияНАДН-ОР лонтрелом (координатыЛайнуивера-Бэрка):

1. –без ингибитора.

Лонтрел: 2. – 0,3'10-4М; 3. – 1,0'10-4М

СНТ= 2,47'10-3М;CНАДН-ОР=1,010-6 М; CНАДН = 1,010-4 1,510-3 М;

Рис.7. Зависимость ингиброванияНАДН-ОР раундапом (координатыЛайнуивера-Бэрка):

1. – без ингибитора.

Раундап: 2. – 1,2'10-3М; 3. – 2,5'10-3М.

СНТ= 2,47'10-3 М;CНАДН-ОР=1,010-6 М;CНАДН = 2,010-4 1,510-3 М;

§2. Действиесолей металлов на процессы окисления,
осуществляемые ферментнымисистемами

Сравнениеингибирования НАДН-OР солями металлов исоответствующими комплексами лонтрелапоказало, что соли Mg(II), Zn(II) и Mn(II) - неингибирует фермент (10-2 М), не зависимо от аниона. Комплексыэтих металлов не взаимодействуют с НАДН(табл. 1).

Рис.8. Кинетические кривыезависимости скорости окисления НАДН-ОР отконцентрации НАДН при постояннойконцентрации НТ: 1. – без ингибитора; Ni(ас)2: 2. - 3,3'10-6М; 3. - 3,0'10-5М; 4. - 1,7'10-4 М.

СНТCl= 2,67'10-3М;CОР=2,83·10-7 М; CНАДН = 1,010-4± 1,510-3М;

Рис.9. Зависимость ингибированияНАДН-ОР Co(ас)2(координаты Лайнуивера-Бэрка): 1. – без ингибитора;Mn(ас)2: 2. -1,3'10-6 М; 3. - 3,0'10-6М.

СНТ = 2,67'10-3 М;CОР = 2,83·10-7 М; CНАДН=(1,010-4 - 1,510-3) М;

Соли Fe(II), Mo(VI), Cu(II), Ni(II),Co(II) обратимо ингибируют НАДН-OP вконцентрациях от 3,3·10-6 М (рис. 8). Комплексы с лонтрелом этихметаллов проявляют высокуюантиредуктазную активность (I50), которая возрастаетв ряду: Fe(асас)2=Mo(ам)6 <Ni(ас)2=Cu(ас)2 <Со(ас)2 (табл. 3).Соли ингибируют фермент в концентрации наодин – трипорядка меньше, чем соответствующиекомплексы. Наибольшая разница у иона Co(II) иСоL2: I50 = 1,3310-6 и 1,510-3 М, соответственно.Минимальная разница - у иона Mo(VI): I50 = 3,310-4 М; MoL2 имеет I50 = 8,510-4 М. Порядоквозрастания величины I50 в случае комплексовобратен ряду для солей металлов: CuL2<MoL2<ZnL2<FeL2=L<CoL2<NiL2= MgL2 <MnL2.

При переходе от солей ккомплексам (за исключением Fe – по НАДН и Mo – по НТ) изменяетсяхарактер ингибирования: СоL2 ингибирует ферментнеконкурентно, а соль – бесконкурентно (рис.9), вероятно, в результате неспецифическоговзаимодействия с белковой матрицей внеактивного центра фермента. Такоевзаимодействие вызывает конформационныеизменения на участке транспорта электрона,что ведёт к уменьшению скоростиферментативной реакции.

Комплексы CuL2, MoL2 и FeL2 конкурируют с НАДН заместо связывания на ферменте (табл. 3).CuL2 ингибируетокисление НАДН почти в 20 раз менееинтенсивно, чем Cu(II), тогда как MoL2 – в 80 раз, по сравнениюс Mo(VI). Наблюдаемые отличия обусловленыразличиями в структуре соединений,изменением характера связи металл-лиганд.В составе комплекса с лонтрелом металл неспособен действовать как свободный катион.Ингибирующим компонентом здесь служит самкомплекс, либо один или оба лиганда,связанные в комплекс. Величины Ki по НАДН изменяется вряду: соль > лиганд > комплекс.Следовательно, антиредуктазная активностьвозрастает при переходе от соли к лиганду ик комплексу. В случае Со и Ni, наоборот,прочность связи фермента с ингибиторомвозрастает при переходе: соль < лиганд <комплекс.

Соли металловконкурентно ингибируют НАДН-ОР поакцептору электронов. По величинамконстанты ингибирования они располагаютсяв ряд: Mo(VI) >Fe(II) > Ni(II)> Cu(II) > Со(II). Длякомплексов в ряду активности по Ki: MnL2 > CoL2 > FeL2 = NiL2 > CuL2 > MgL2 > ZnL2 > MoL2 наблюдаетсяпрактически та же закономерность:прочность связываниятоксиканта-ингибитора возрастает припереходе: соль < лиганд < комплекс. Вповедении солей определяющим факторомявляется ион металла и строение егоэлектронных оболочек, поэтомурассмотренные соли металлов неконкурируют с НАДН за место связывания. Вкомплексах металлов доминирующим влияниемобладает лигандное окружение. Пиридиновоекольцо имеет строение близкое к НАДН, т.е.способно занять место субстрата на белке, а

атомазота может отдать неподелённую паруэлектронов. Изменение координационнойсферы металла (лигандного окружения),приводит к кардинальным изменениям вхарактере ингибирования. Выше намипоказано, что металлы в комплексахпроявляют высокие степеникоординации могут образовывать полимерныецепочки, где лиганд выполняет роль«мостика»: L-M-L-Fe-ОР, согласно схеме 2.

Схема2

Коэффициет Хилла h = 1 длярассмотренных солей металлов - к ферментуприсоединяется только один ион. Укомплексов и токсикантов - ингибиторов–потенциальных лигандов, h = 1,5 2,0. Две молекулы токсиканта или егометаллокомплекса связываются с одноймолекулой фермента. Поскольку токсикантылегко взаимодействуют с металлами, видимо,одним местом присоединения их на ферментеявляется ион металла, входящий в составактивного центра (в форме 2Fe -2S кластера), авторым –аминокислоты белковой матрицы.

Глава 6.ВЛИЯНИЕ ЭКОТОКСИКАНТОВ НА ПРОНИЦАЕМОСТЬКЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН

Мембраны клетокспециально созданы природой длясохранения внутриклеточ-

ного химическогосостава, и для защиты организмов отксенобиотиков, находящихся в окружающейсреде. Транспорт ЗВ через мембраныявляется первичной и лимитирующей стадией,предшествующей химическомувзаимодействию токсиканта сбиологическими молекулами.

§1. Кинетикапереноса токсикантов через липосомальныемембраны

Процесс массопереносаЗВ через мембрану внутрь клетки изучалсянами на липосомах, начинённых -АТФ (рис. 10) потушению флуоресценции. Для количест-

венной характеристики нами быласоздана математическая модель процесса,согласно которой концентрация -АТФ внутри липосом [E]связана с экспериментально измеряемойинтенсивностью флуоресценции I(t)соотношением: [E]=[E0]·I(t)/I(0), где I(0) – начальная величина свечения вячейке до прибавления токсиканта -тушителя. Скорость переноса пестицидачерез липидную мембрану j(t), описываетсяуравнением:

в котором, - Kк/о – константакомплексообразования ЗВ с -АТФ.

Расчётудовлетворительно описываетэкспериментальные данные. Скоростьпереноса пестицида через липиднуюмембрану не зависит от градиентаконцентраций (j = const), не зависит от исходнойконцентрации, оставаясь посто-

Рис.10. Изменение интенсивностифлуоресценции инкапсулированной -АТФ от временивоздействия лонтрела (точки 1-3) и CoL2 (точки 4–6).

Концентрация -АТФ = 1·10-4 М.

Концентрациягербицидов в рабочей кювете: 110-4 (1, 4); 1·10-3 (2, 5); 1·10-2 (3, 6) М. Точки – данные эксперимента.Сплошная линия – расчёт.

янной при измененииконцентрации от 10-2 до 10-4М,определяется исключительно свойствамилипидного бислоя и строением молекулыксенобиотика. Токсиканты,характеризующиеся высокими значениямиконстант комплексообразования обладаютменьшей скоростью проникновения черезмембраны клеток.

Наибольшую скоростьпереноса проявили сетоксидим (j=41,2·10-8 Мс-1) и кузагард(j=14,7·10-8Мс-1) (табл. 4).Эти соединения обладают сложным строенем,имеют в своём составе значительные поразмерам органические жирные фрагменты.Близкими оказываются скорости переносабазаграна и лонтрела. Зенкор – самый активныйкомплексообразователь, имеет наименьшуюскорость переноса. Значения константмассопереноса имеют обратную корреляциюсо значениями Кк/о с -АТФ– с ихспособностью к образованию комплексов сфункциональными молекулами живой клетки:АТФ, НАДН, ДНК, РНК. По величинам Кк\о с -АТФ ряд активностивыглядит: CuL2 =CoL2 > зенкор > NiL2> лонтрел> кузагард> FeL2 > раундап > сетоксидим > базагран > MoL2 > тачигарен > тилт. По величинескорости массопереноса, рассмотренныесоединения выстраиваются в ряд: зенкор< лонтрел< базагран< CoL2 <раундап <кузагард <CuL2 < сетоксидим.

Таблица 4. Значения констант массопереноса ЗВчерез липосомальную мембрану


Названия

веществ

J·108,М·с-1

cр. J·108,

М·с-1

Koct/H2O

Koct/H2O

исходные концентрации

10-2, М

10-3, М

10-4, М

20мин

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |   ...   | 13 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»