WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 13 |

Для выяснения влиянияпестицидов на вторичную структурунуклеиновых кислот проводили термическуюденатурацию ДНК. Вещества с высокимиКк/обр образуютнаиболее прочные комплексы с аденином иоказывают глубокое воздействие наструктуру ДНК. Под их влиянием плавлениеДНК становится не кооперативным (рис. 4),гиперхромный эффект (ГЭ) значителен (40% вконтроле; 6-7% у зенкора и лонтрела).Кузагард, сетоксидим, металлокомплексыимеют высокую константу связывания, ноиз-за больших размеров и разветвлённогостроения не в состоянии внедриться вдвойную спираль и полностью нарушитьнативность. Плавление ДНК остаётсякооперативным. Однако, температураплавления уменьшается на несколькоградусов, интервал плавленияувеличивается (почти в два раза дляСоL2), ГЭзначителен - до 10% у MoL2. Таким образом, идёт процессотщепления от ДНК низкомолекулярныхпродуктов в результате гидролизафосфодиэфирных связей.

§3. Изменениеструктуры ДНК под действиемксенобиотиков

ХОС, в частности2,4,6-трихлорфенол (ТХФ) в концентрации10-7 – 10-6 М не нарушаютнативности двойной спирали ДНК, оказываяна неё не глубокое воздействие. Приплавлении Т0нач.пл., интервалплавления и Тпл0С – близки к контролю,лишь ГЭ уменьшается в два раза (табл. 2). Привозрастании концентрации ТХФ от 10-6 – 10-2 М, Т0нач.пл. снижается, интервал Тпл0Свозрастает. В результате комплек сованиямолекул ТХФ с адениновыми основаниями ДНК,происходит интеркаляция ТХФ междупуриновыми и пиримидиновыми основаниями,перекомплексование, приводящее кгидролизу фосфодиэфирных связей ивыщеплению оснований - к образованиюнизкомолекулярных алкилированныхпродуктов.

По мере ростаконцентрации ТХФ, ГЭ монотонно снижается(рис. 5) до 11,3% - почти в 3 раза по сравнению сконтролем. Для максимальной изисследовавшихся концентраций ТХФ = 10-2 М, Тпл 0С существенно ниже,чем у чистой ДНК. Однако, характерплавления во всём диапазоне рассмотренныхконцентраций остаётся кооперативным– плавлениеодного участка приводит к плавлениюдругого, т.е. ТХФ в большей степенивзаимодействует с концами полимерноймолекулы, «отрезая» от неёнизкомолекулярные куски. Молекулылонтрела (3,6-ДХПК) и ТХФ, имеющиеаналогичную пространственную структуру,образует комплексы с имидным водородомаденина или карбоксильным кислородомцитозина в цепи: гуанин-цитозин,

Таблица 2. Структурные изменения ДНК вприсутствии токсикантов

Название

-ДНК

Кк/о·10-3М-1

-РНК

Кк/о·10-3М-1

Тпл 0С

ГЭ, %

ТХФ М

Тпл 0С

ГЭ, %

Контроль

Лонтрел

Зенкор

Раундап

Кузагард

Тачигарен

Тилт

Сетоксидим

CuL2

CoL2

NiL2

FeL2

MoL2

1,4±0,2

7,0±0,7

0,54±0,02

1,5±0,1

0,12±0,01

0,10±0,01

3,6±0,5

1,5±0,4

4,1±0,2

3,3±0,2

0,43±0,03

5,4±0,3

2,0±0,2

10,8±1,3

1,00±0,05

1,47±0,05

0,83±0,07

0,20±0,04

5,9±1,1

2,3±0,3

4,6±0,2

4,8±0,2

0,48±0,02

7,3±0,5

74,6

н/к

-“-

-“-“-

72,6

72,5

73,2

74,3

67,2

73,6

71,0

72,8

74,5

40,10

6,30

7,60

10,00

24,17

37,83

15,00

13,15

16,50

36,49

22,50

35,40

10,75

Конт

10-2

10-3

6·10-4

3·10-4

10-4

5·10-5

10-5

10-6

10-7

-

-

-

61

60,5

57,5

56,5

56,5

58

56,5

57

60

62

-

-

-

37,0

19,0

18,4

15,5

20,5

18,7

14,7

15,8

11,3

17,7

-

-

-

аденин-тимин, согласносхеме 1. По мере роста концентрациитоксиканта растёт количество такихкомплексов на одной молекуле ДНК. За счётобразования комплексов ЗВ происходитнарушение вторичной и первичной структурДНК.

Рис.5. Кинетика изменениягиперхромного эффекта и температурыплавления ДНК под действием2,4,6-трихлорфенола:

1, 5 - ТХФ без облучения(расчёт);

2, 4 - ТХФ при облучении = 313 нм; 3, 6– ТХФ +бенгальский розовый,

= 540 нм.

Правая шкала: кривые 1– 3.

Левая шкала: кривые 4– 6.

Судя по влиянию на ДНК,продукты, образующиеся при фотолизе ТХФ, независят от длины волны облучения (УФ - 254, 313;VIS - 540 нм), но сильно изменяются приувеличении времени экспозиции. По мереувеличения концентрации продуктовразложения ТХФ – дибензофенола (ДБФ) и дибензофурана(ДБФур), происходит понижение Тпл 0С, Т0нач.пл,увеличение интервала плавления. Кмаксимальному гидролизу фосфодиэфирныхсвязей ДНК приводит смесь ТХФ и продуктовего 50-60%-ной трансформации. Продуктыполного разложения ТХФ (100% превращения) вбольшей степени воздействуют на вторичнуюструктуру ДНК (рис. 5, кривая 2), чем сам ТХФ.Об этом свидетельствует значительноеуменьшение величины ГЭ – до 10,6%. Мы считаем,что образуемые ДБФ и ДБФр комплексы стимином, аденином, гуанином и цитозиномприводят к разрыву водородных связей междупуриновыми основаниями, и к нарушениюнативности двойной спирали и, в конечномитоге, - разделению двух комплементарныхполинуклеотидных цепей.

Схема 1

Такие ЗВ, как красители,ведут себя по отношению к ДНК по - разному:бенгальский розовый (БР) не оказываетвлияния на плавление ДНК. Присенсибилизированном фотолизе БР и ТХФ,между ними образуются комплексы, которые вменьшей степени воздействуют на ДНК, чемчистый ТХФ. Метиленовый голубой (МГ),самостоятельно без ТХФ вызывает серьёзныенарушения вторичной структуры ДНК. Под еговлиянием плавление ДНК становится некооперативным, ГЭ = 5,7%. Столь существенныйГЭ, даёт нам основание считать, чтопроисходит полное нарушение нативностидвойной спирали. Таким образом, МГ образуеткомплексы с пуриновыми основаниями, чтоприводит к разрыву пептидных связей инарушению комплементарности спиралиДНК.

Глава 5.ТЕХНОГЕННЫЕ ТОКСИКАНТЫ КАК ИНГИБИТОРЫ
ОКИСЛИТЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТАТИВНЫХПРОЦЕССОВ

Хорошо известно, что всеокислительные процессы в клеткекатализируются ферментами. Очевидно, чтовещество, в следовых количествахоказывающее биологическое действие,влияет на какую-либо ферментную реакцию. Вкачестве примера нами было изученоингибирование техногенными токсикантамиНАДН–оксидоредуктазы (НАДН-OP), обладающейширокой субстратной специфичностью. Вчастности, НАДН-OP участвует в окисленииметана и его галлогензамещённых доформальдегида; СО до СО2; алканов до спиртов;алкенов до эпоксисоединений; NH3 до гидроксиламина,катализирует включение атома кислорода поС-Н, N-H, C=C и C=O связям.

§1.Ингибирование экотоксикантамиНАДН-оксидоредуктазной реакции

Наибольшей ингибирующейактивностью обладают зенкор и лонтрел.Концен- трации, приводящие к инактивациифермента на 50% (I50), у них наименьшие (табл. 3).Ингибирующая способность Сu-, Мо-, FеL2 выше, чем у исходноголонтрела. Константа Михаэлиса по доноруэлектронов НАДН составила Km(НАДН) =0,66·10-3 М; по акцепторуэлектронов неотетразолию хлористому -Km(НТ) =2,47·10-3М.

Лонтрел, зенкор,кузагард, тачигарен, Сu-, Fе-, Mn-, МоL2 конкурентноингибируют редуктазу по донору электронов(рис. 6), видимо, являясь его структурныманалогом, пестицид связывается с ферментомв месте присоединения НАДН с образованиемнепродуктивного комплекса. Сетоксидим,раундап, тилт, Мg-, Ni-, Zn-, СоL2 - неконкурентноингибируют фермент по НАДН (рис. 7). Причём,при постоянном значении Km величина Vmax уменьшилась посравнению с опытом без ингибитора с7,4·10-6 лМ-1с-1 до (2,0; 2,0; 2,2)·10-6, соответственно. Рядактивности соединений, выстроенный повеличинам константы ингибирования(Кi) по НАДН:CuL2<МоL2<зенкор<лонтрел<FeL2<MnL2<ZnL2<NiL2<MgL2<базагран<СоL2 <кузагард<тачигарен<раундап<тилт<сетоксидим.

Таблица 3. Влияние токсикантов наНАДН-оксидоредуктазу

Пестицид или комплекс -без ингибитора: Vmax = 7,4010-6 Мсек-1;S1 = 6,5810-3M; S2 = 2,6510-3M. Соль- без ингибитора: Vmax = 2,75·10-6Мсек-1;S1=1,54·10-4М; S2 = 3,30·10-4М. Тип ингибирования (Т/и): к– конкурентный;н –неконкурентный; б – бесконкупнтный; с - смешанный

Ингибитор

I50,M

Vmax,

Мсек-1

S1,M НАДН,

Кi·104М

НАДН

Т/и

Vmax,

Мсек-1

S2, M(НT)

Кi104M НT

Т/и

лонтрел

1,110-3

1,2310-3

1,00

к

1,8810-6

6,9810-4

7,42

б

зенкор

5,010-4

4,9310-3

0,25

к

0,2310-6

3,3910-4

8,94

б

базагран

6,010-4

1,8210-6

1,8310-4

12,80

б

0,2610-6

2,5510-4

8,40

б

раундап

1,710-3

3,3310-6

6,1710-4

22,00

н

0,2110-6

2,0010-4

42,9

б

кузагард

2,710-2

9,8610-3

14,00

к

5,7210-3

159

к

сетокс.

1,710-2

2,0010-6

7,5910-4

397,5

н

11,0010-3

8,04

к

тачигар.

2,710-3

2,4710-3

21,00

к

5,3010-3

4,55

к

тилт

2,210-3

1,2510-4

5,9810-4

23,00

н

13,0010-3

1,52

к

MgL2

2,010-3

1,6610-6

8,9710-4

12,67

н

23,8310-3

3,55

к

MnL2

3,010-3

4,9310-3

3,80

к

1,7210-6

1,8110-3

22,3

c

ZnL2

1,0 10-3

2,0010-6

8,2210-4

10,19

н

1,110-6

1,7210-3

2,46

c

CuL2

3,310-4

32,910-3

0,06

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 13 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»