WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 13 |

В этой главе собраны иобобщены литературные данные повоздействию техногенных токсикантов наокружающую природу. Сопоставленыразличные точки зрения на механизмдействия пестицидов. Освещена рольмикроэлементов в жизнедеятельности живыхорганизмов, с которыми, главным образом,связываются процессыкомплексообразования в биологическихсистемах. Проведённый анализ литературныхданных показывает, что, несмотря намногочисленные исследования молекулярныхмеханизмов действия различныхтоксикантов, как на модельных системах, таки на реальных биологических объектах,многое в этом вопросе остаётся не ясным. Намомент начала исследований, вплоть донастоящего времени, данные о ролипроцессов комплексообразования вмеханизме действия ЗВ, и формированиитоксичности ограничены и связываютсяисключительно с ролью металлов. С другойстороны, вопросы, связанные смолекулярными взаимодействиями ЗВ вметаболических процессах так жерассматриваются весьма узко,ограничиваясь, как правило, однойферментной системой. На основекритического анализа литературных данныхнами были сформулированы конкретныезадачи исследования, определенапоследовательность их решения.

Глава 2.СПОСОБЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВОЗДЕЙСТВИЯ ЗВ НАМОЛЕКУЛЯРНОМ УРОВНЕ НА КОМПОНЕНТЫ КЛЕТКИ ИВОДНЫЕ ОБЪЕКТЫ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ.Объекты и методы исследований

В качестве объектаисследования взяты действующие веществавосьми широко используемых пестицидовразличного химического строения(гербициды: раундап, базагран, кузагард,сетоксидим, лонтрел, зенкор; фунгициды:тачигарен, тилт); хлорпроизводное фенола–2,4,6-трихлорфенол; красители – бенгальский розовыйи метиленовый голубой; соли и бидентатныекомплексы лонтрела с ионами 8 металлов (Cu, Co,Mo, Mn, Mg, Fe, Zn, Ni).

Состав и строениесинтезированных комплексов исследовалиметодами элементного анализа, ЭПР, ИК иэлектронной спектроскопии,рентгенографии. Образование комплексов снуклеотидами изучали флуоресцентнымметодом, при концентрации ЗВ от 10-8 до 10-2 М. Определениетемпературы плавления ДНК проводилиспектроскопически в термостатируемойкювете.

В работе использоваласьвыделенная из мембранных структур клетокметанокисляющих бактерий Methylococus capsulatus (штамм М,КФ 1.6.99.25), дополнительно очищеннаяНАДН-оксидоредуктаза, молекулярная масса180 кДа. Кинетические параметры и типингибирования определяли по методикеМихаэлиса-Ментен. Проникновение ЗВ черезмембраны изучали на бислойных липосомах изфосфатидилхолина и холестерина. В качествефлуоресцентной метки использовалосьэтенопроизводное аденозинтрифосфорнойкислоты (-АТФ):спектр возбуждения =312нм, максимум флуоресценции=420 нм.

Анализ влиянияпестицидов и комплексов на прорастаниесемян, рост растений и содержаниехлорофилла, проводили на однодольных(озимая пшеница «Мироновская 80») идвудольных (горох «Улановский юбилейный»)растениях. Жизненные циклы и популяционнуюдинамику микроартропод испытывали напочвообитающих коллемболах видов Folsomia candida (Isotomidae) и Ceratophysella denticulate.Токсикологическую оценку водных растворовэкотоксикантов выполняли на культуреинфузорий Tetrahymena pyriformis и светящихся бактериях Benekea harvey (штамм В 1 7) постандартным методикам. Генотоксичностьопределяли на модифицированном тестеЭймса Salmonella/микросомы.

Биохимическоеповедение лонтрела и Сu(лонтрел)2 изучали влабораторном аэротенке, на активном илеочистных сооружений, подвергнутоммутагенной обработкенитрозометилмочевиной. Фотохимическоеразложение проводили в кварцевом реакторе;использовали лампы марок ДРШ-1000, ДРБ-8 иБРА-15 с длинами волн излучения в диапазоне250-600 нм и барботированием кислородом,озоном, воздухом, аргоном. Продуктыфоторазложения лонтрела установленыгазовым хроматомасс-спектрометрическимметодом. Определение ЗВ в процессемониторинга Волги выполняливысокоэффективной жидкостнойхроматографией.

Глава 3.ХЕЛАТИРОВАНИЕ МЕТАЛЛОВ, КАК ОДНА ИЗ ПРИЧИНУВЕЛИЧЕНИЯ ТОКСИЧНОСТИКСЕНОБИОТИКОВ

Пестициды и металлыявляются в настоящее время преобладающимиЗВ окружающей среды; с другой стороны–микроэлементы входят в состав клеток живыхорганизмов. Естественно, что изучениепроцессов комплексообразования былиначаты с исследования взаимодействияметаллов и пестицидов.

§1. Синтез исвойства бидентатных комплексовЗВ

Изучаласькомплексообразующая способность лонтрела(3,6-дихлорпиколиновой кислоты - 3,6-ДХПК = L) и3,4,5-ТХПК с металлами: Со(II), Mn(II), Cu(II), Ni(II), Mg(II),Мо(IV), Zn(II), Fe(II). Комплексы получены привзаимодействии спиртового растворалонтрела с водными растворами различныхсолей: хлоридами, карбонатами, сульфатами,аммиакатами. Во всех случаях происходитобразование комплексов соотношения 1:2. В ИКспектрах всех комплексов присутствуютполосы поглощения (п.п.) в пределах 1610-1590см-1,соответствующие (С=О) координированной. Появление вспектрах комплексов новой п.п.

в области1620 см-1указывает на существованиекоординированной группы СОО- по типу О-М-О, т.е. наобразование прочной ковалентной связиметалл-кислород. Интенсивная п.п. 920см-1 в спектрелонтрела принадлежит (С-N). А её отсутствие вспектрах комплексов указывает наперераспределение энергии данной связипри образовании новых соединений. Вновьпоявляющуюся во всех спектрах п.п. вобласти 460 см-1можно идентифицировать как (М-N). Соответственноустановлены п.п., принадлежащие (O-М-О) и (N-М-N).

Рис. 1. Строениекомплекса CuL2

Анализ ИК спектровсинтезированных комплексов показалследующий порядок (COO-):Ni=Fe<Мо=Со<Сu<Мn<Zn<Мg. Известно, чточастота валентного колебания карбонилауменьшается симбатно увеличению константыустойчивости комплекса, т.е. NiL2 и FeL2 наиболее прочные, аМnL2, ZnL2 и МgL2 - наименее.

Данныерентгеноструктурного анализа трёх медныхкомплексов показали, что они имеютоктаэдрическое строение с разной степеньюискажения координационного полиэдра. Вцентросимметричном комплексе (рис. 1)хлорпиколиновые фрагменты связаны сметаллом атомами азота и одного из атомовкислорода карбоксильной группы собразованием пятичленных металлоциклов.Кристаллы СuL2имеют полимерную цепочечную структуру. Дооктаэдрической координации атом Сuдополняется двумя атомами кислородакарбоксильной группы соседней молекулы, cобразованием 4-х членного хелатногометаллоцикла. В результате один излигандов является концевым, а второй -мостиковым. При этом образуется полимернаяцепь - Сu-O-Сu- с расстояниями Сu-O 2,13 и2,740А.

§2. Поведениеметаллокомплексов в водныхрастворах

Мелкодисперсныеобразцы комплексов CuL2 имеют аксиально-симметричныйспектр ЭПР. Существенное отличие g-фактораот чисто спинового и форма спектрасвидетельствуют о значительной примесиорбитального магнитного момента всуммарном магнитном моменте неспаренногоэлектрона, что свидетельствует обоктаэдрическом искажениикристаллического поля лигандов. Изсравнения спектров ЭПР замороженныхрастворов следует, что при растворении вводе все комплексы сохраняюткоординационное окружение центральногоядра. Слабое уширение сигналоврастворённых в воде образцов при 300 Ксвидетельствует о частичном спариванииэлектронов, т.е. объединении двух и болеемолекул в полимерные цепочки, аналогичные[Сu(L)2]n.

Таким образом, внативных условиях рассмотренные комплексысуществуют как единое целое внедиссоциированном состоянии. Ониспособны участвовать в дальнейшемкомплексообразовании с биоактивнымилигандами за счёт заполнениякоординационной сферы металла. В воднойэкосистеме с широким набором ЗВ, возможнообразование комплексных соединений,аналогичных рассмотренным.

Глава 4.НУКЛЕОТИДЫ КАК ОБЪЕКТ АТАКИКСЕНОБИОТИКОВ

Состав биологическихмакромолекул прост в своей основе. Всеживые организмы состоят из одних и тех жемолекул, используемых как строительныеблоки. Такими «блоками», в частности,являются нуклеотиды, играющие одну изключевых функций в метаболизме ирепликации, выполняют энергетические ирегуляторные процессы, участвуют вбиосинтезе. Клетки организмов улавливают,сохраняют и передают энергию в химическойформе, главным образом в виде энергии,заключённой в молекулах мононуклеотидаАТФ. Поэтому мы исследовали образованиекомплексов с нуклеотидами пестицидов и ихкомплексов с металлами.

§1.Комплексование техногенных токсикантов сАТФ

Тушение флуоресценции-АТФнаблюдается при концентрации пестицида от10-7 до 10-2 М, чтосвидетельствует о возникновениикомплексов -ATФ-пестицид.

Таблица 1.Значения константкомплексообразования нуклеотидов спестицидами и металлокомплексамигербицида лонтрел (Кк/обр, М-1)

Соединение

Кк/о·10-3,M-1

-АТФ

рН = 6,8

Кк/обр·10-3,M-1

-НАДН

Сое-динение

Кк/обр·10-3,М-1

-АТФ

рН = 6,8

Кк/о·10-3,

М-1

АТФ

рН = 1,68

Кк/обр·10-3,M-1

-НАДН

Базагран

Зенкор

Кузагард

Лонтрел

Раундап

Сетоксид

Тачигрен

Тилт

4,7±0,4

26,5±3,3

9,7±0,5

15,0±2

8,2±1,2

5,0±0,3

1,1±0,04

0,8±0,06

-

21,33±1,5

2,51±0,04

11,70±0,4

2,20±0,41

2,84±0,71

1,80±0,39

0,46±0,06

MgL2

MnL2

FeL2

CoL2

NiL2

CuL2

ZnL2

MoL2

0,8±0,02

2,2±0,1

8,8±0,4

600±200

21,6±0,5

851,4±82

1,6±0,06

3,6±0,4

21,1±14,6

40,4±14,8

47,2±20,3

32,2±0,6

105,8±54

296,6±90

86,3±18

-

-

-

0,55±0,06

3,05±0,14

4,74±0,34

4,56±0,16

-

2,15±0,07

Для уточнения механизмаобразования, и оценки константустойчивости комплексов нами была созданаматематическая модель процесса.Предполагалось, что взамодействиепестцидов (Р) с -АТФ (Е) происходит по схеме:

,

где П – комплекс; n – стехиометрическийкоэффициент; Кк/обр = k+/k- -константа

комплексообразования:

Определённыйстехиометрический коэффициент n для всехизученных соединений равен 1±0,2, т.е. с одноймолекулой -АТФвзаимодействует лишь одна молекулапестицида. По найденным значениям Кк/обр и n рассчитывалитеоретические кривые титрования. Всерассчёты проводили на ЭВМ БЭСМ-6. На рис. 2приведены экспериментальные зависимостиизменения относительной флуоресценции(I/I0) от исходнойконцентрации пестицида (Р0) и соответствующие имтеоретические кривые для гербицидалонтрел и комплекса СuL2, рассчитанные понайденным зна-

Рис.2. Зависимость измененияотносительной флуоресценции отконцентрации пестицида илиметаллокомплекса:

1 - лонтрел с -АТФ; 2 - лонтрел с АТФ;3 - CuL2 с -АТФ; 4 - CuL2 с АТФ.

Сплошная линия – теоретическаякривая, точки –данные эксперимента. Концентрации: -АТФ=1·10-5M; АТФ=2·10-4M;

чениям n и константыкомплексообразования (Кк/обр). Наиболеепрочные комплексы c -АТФ образуют зенкор и лонтрел, анаиболее слабые - тилт и тачигарен.Величина Кк/обризученных пестицидов изменяется в ряду:зенкор > лонтрел> кузагард > раундап >сетоксидим > базагран >тачигарен>тилт(табл. 1).

Рис.3. Строение тройногокомплекса -АТФс металлокомплексами гербицида лонтрел =[-АТФ-Cu(L)2].

Рис.4. Кривые плавления ДНК:

1. – контроль. В присутствии: 2. - лонтрел,3. - Fe(L)2.

В случае комплексов Сu-,Со-, NiL2 - Кк/обр c -АТФ выше, чем уисходного лонтрела; у комплексов другихметаллов, на один - два порядка ниже.Прочность комплексов -АТФ с комплексамиМ(L)2 = [-АТФ-М(L)2] изменяется в ряду: Сu> Co > Ni > Fe > Мo > Мn > Zn > Mg.

Структура комплекса-АТФ сметаллокомплексами лонтрела представленана рис. 3. Тушение флуоресценции АТФ, как и вслучае -ATФ,происходит без изменения положениямаксимума возбуждения и эмиссиифлуоресценции. Комплекс [АТФ-ЗВ] образуетсяза счёт протонирования атома азота N-7аденинового гетероцикла, одновременноатом азота терминальной NH2- группы можетсвязываться с молекулой ЗВ за счётобразования водородной связи. Прочностькомплексов с АТФ в 5 – 10 раз выше, чем с -АТФ (табл. 1).

§2.Взаимодействие ЗВ с ди- иполинуклеотидами

Результатом тушенияфлуоресценции этенопроизводногодинуклеотида НАДН (-НАДН) является образованиековалентной связи с адениновым фрагментом.С одним модифицированным звеномвзаимодействует лишь одна молекулапестицида. Константыкомплексообразования, рассчитанные наодно звено представлены в табл. 1. Повеличинам Кк/обр пестициды выстраиваются вгипотетический ряд активности, идентичныйполученному при взаимодействии с ATФ:наибольшей Кк/обр обладает зенкор, наименьшейтачигарен и тилт. Комплексы лонтрела с Сu,Со, Ni, Fe, Мо образуют прочные комплексы сдинуклеотидом (табл. 1). При взаимодействиис ДНК и РНК СuL2,СоL2, NiL2, МоL2 имеют Кк/обр выше, чем лонтрел(табл. 2).

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 13 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»