WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 |

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ им. И.П. ПАВЛОВА

________________________________________________________________

На правах рукописи

РУДЕНКО

Яков Николаевич

КИНЕТИКА МЕТАБОЛИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ОБОНЯТЕЛЬНОЙ ВЫСТИЛКИ ТРАВЯНОЙ ЛЯГУШКИ (Rana temporaria)

ПОД ДЕЙСТВИЕМ ОДОРАНТОВ

03.00.13 – физиология

03.00.02 – биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург

2007

Работа выполнена в лаборатории физиологии и биофизики клетки

Института физиологии им. И.П. Павлова РАН

Научные руководители: член-корреспондент РАМН,

доктор медицинских наук, профессор Самойлов Владимир Олегович

доктор биологических наук,

ведущий научный сотрудник, доцент

Бигдай Елена Владимировна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Лебедев Олег Евгеньевич

доктор медицинских наук, профессор

Голубев Виктор Николаевич

Ведущая организация: Институт цитологии РАН

Защита диссертации состоится « 21 » мая 2007 года в 13 час. 00 мин. на заседании Диссертационного Совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д 002.020.01) при Институте физиологии им. И.П. Павлова РАН (199034, Санкт-Петербург, наб. Макарова, 6)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии им. И.П. Павлова РАН

Автореферат разослан «___» апреля 2007 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета

доктор биологических наук Н.Э. Ордян

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Для обонятельной рецепции так же, как для вкусовой, каротидной и медуллярной (Самойлов, 1983), доказано наличие гетерогенных механизмов трансдукции пахучих веществ, обладающих различными запахами (Бигдай, 2004; Бигдай, Самойлов, 2004). Можно предположить, что эта гетерогенность будет проявляться и в разной кинетике рецепторных процессов, но данный вопрос совершенно не разработан.

Обоняние ухудшается с возрастом (Murphy et al., 2002; Rawson, 2006), а также при нейродегенеративных заболеваниях, таких как болезни Паркинсона и Альцгеймера (Mesholam et al., 1998; Devanand et al., 2000; Hawkes et al., 2003). При болезни Паркинсона (Muzino et al., 1989; Schapira et al., 1989) и старении (Lenaz et al., 1998) наблюдается дефицит первого комплекса дыхательной цепи (ДЦ) митохондрий, что приводит к нарушению митохондриального дыхания и снижению синтеза АТФ (Yagi et al., 2001), а, следовательно, к ухудшению энергетического обеспечения процессов обонятельной рецепции. Это в конечном итоге может приводить к притуплению обоняния, вследствие чего ухудшается качество жизни пациентов (Hummel, Nordin, 2005). Ослабление способности ощущать запахи у человека, страдающего болезнью Альцгеймера, также сопровождается нарушением функционирования митохондрий. (Perry et al., 2003). Вместе с тем на сегодняшний день мало исследований, посвященных изучению митохондриального дыхания в обонятельных клетках. Недавно было показано (Бигдай, 2004), что в обонятельных клетках под действием одорантов происходит активация ДЦ митохондрий, которая проявляется в изменении интенсивности собственной флуоресценции НАДН (восстановленного никотинамидадениндинуклеотида) и ФП (флавопротеидов).

Установлено, что человек воспринимает около 10000 различных запахов (Keller, Vosshall, 2004), а животные макроосматики, вероятно, еще больше. Возможно, различия в восприятии веществ, обладающих разными запахами, связаны не только с наличием специфических мембранных рецепторов (Malnic et al., 1999), но и с различными скоростями развития метаболических реакций в обонятельных клетках. Однако кинетические параметры метаболических процессов в обонятельных клетках, включая их флуориметрические проявления, до сих пор не исследованы.

Поэтому настоящая работа посвящена изучению кинетики метаболических процессов в рецепторных клетках обонятельного эпителия лягушки под действием одорантов, вовлекающих в обонятельную трансдукцию различные механизмы. Детальная разработка этой проблемы может оказаться полезной для создания искусственных обонятельных сенсоров, а также для медикаментозной коррекции некоторых нарушений обоняния. Исследование механизмов действия аммиака и сероводорода на обонятельный эпителий поможет установить предельно допустимые концентрации данных ирритантов в производственных помещениях (Карпов, 1972; Михайлуц, Суглобова, 1989). Поэтому настоящее исследование имеет не только фундаментальное, но и прикладное значение для профилактической и клинической медицины.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью работы было изучение кинетики флуоресценции НАДН и флавопротеидов, а также Ca2+-аккумулирующей способности клеточных мембран в обонятельной выстилке лягушки под действием одорантов.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить кинетику собственной флуоресценции НАДН и флавопротеидов, а также Ca2+-аккумулирующей способности клеточных мембран в обонятельной выстилке лягушки при стимуляции обонятельных клеток амиловым спиртом, цинеолом, камфорой, ванилином, аммиаком и -меркаптоэтанолом.

2. Проанализировать взаимосвязь скорости нарастания и продолжительности реакций мембраносвязанного кальция с аналогичными показателями НАДН и флавопротеидов.

3. Сравнить полученные показатели кинетики флуоресценции мембраносвязанного кальция, НАДН и флавопротеидов под действием одорантов, трансдукция которых обеспечивается различными молекулярными механизмами.

4. Провести фармакологический анализ действия одорантов на активность дыхательной цепи митохондрий.

5. Установить зависимость двигательной активности обонятельных жгутиков от ее энергетического обеспечения.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

  1. Одоранты, в обонятельную трансдукцию которых вовлечены системы вторичных мессенджеров (амиловый спирт, цинеол, камфора и ванилин), активируют сукцинатдегидрогеназу (СДГ).
  2. Кинетические параметры изменений Ca2+-аккумулирующей способности клеточных мембран обонятельной выстилки, происходящих под действием амилового спирта, цинеола, камфоры и ванилина, коррелируют с аналогичными показателями динамики флуоресценции НАДН.
  3. Кинетика флуоресценции НАДН и мембраносвязанного кальция различна для амилового спирта, цинеола, камфоры и ванилина, что обусловлено участием разных внутриклеточных сигнальных систем в трансдукции этих одорантов.
  4. Кинетика реакций мембраносвязанного кальция, а также НАДН и ФП на стимуляцию обонятельной выстилки аммиаком и -меркаптоэтанолом отличается от кинетики реакций на амиловый спирт, цинеол, камфору и ванилин, что объясняется разными механизмами трансдукции этих одорантов.
  5. Неодинаковая кинетика собственной флуоресценции НАДН, ФП и Ca2+-аккумулирующей способности клеточных мембран обонятельной выстилки на различные одоранты подтверждает основные положения теории гетерогенности хемосенсорных систем.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые исследована кинетика флуоресценции НАДН и ФП в рецепторных клетках обонятельного эпителия лягушки в ответ на стимуляцию амиловым спиртом, цинеолом, камфорой и ванилином, а также аммиаком и -меркаптоэтанолом.

При изучении реакций на амиловый спирт, цинеол, камфору и ванилин впервые выявлена взаимосвязь кинетики флуоресценции НАДН с кинетикой Ca2+-аккумулирующей способности клеточных мембран в обонятельной выстилке. Кинетические показатели для разных одорантов оказались различными, что обусловлено гетерогенностью молекулярных механизмов их трансдукции.

Впервые показано, что скорость нарастания интенсивности вторичной флуоресценции комплекса: Ca2+-хлортетрациклин-клеточная мембрана (Ca2+-ХТЦ-КМ) под действием амилового спирта, цинеола, камфоры и ванилина примерно в три раза превосходит аналогичный показатель собственной флуоресценции НАДН. Аммиак в сравнении с другими одорантами вызывает наиболее длительные реакции усиления флуоресценции мембраносвязанного кальция.

При сопоставлении скорости усиления собственной флуоресценции НАДН и ФП в обонятельной выстилке лягушки под действием амилового спирта, цинеола, камфоры и ванилина с аналогичным показателем в гепатоцитах крысы, стимулированных гормонами (Hajnoczky et al., 1995), впервые установлено, что кинетика метаболических процессов в обонятельных клетках пойкилотермного животного в 4–5 раз выше, чем в гепатоцитах гомойотермного.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Работа имеет важное теоретическое значение для развития физиологии и биофизики хемосенсорных систем, так как расширяет представление о гетерогенности хеморецепции. Гетерогенность обоняния проявляется в том, что одоранты, вовлекающие в трансдукцию разные биофизические и биохимические механизмы, обладают различной кинетикой развития метаболических процессов в обонятельных клетках. Научно-теоретические положения и выводы из работы могут быть использованы в учебном процессе на кафедрах физиологии в высших учебных заведениях медицинского и биологического профиля.

На основе полученных в нашей работе данных по кинетике метаболических процессов в обонятельных клетках под действием одорантов могут быть разработаны новые медицинские технологии для диагностики и лечения тех форм патологии обоняния, которые связаны с нарушением функционирования митохондрий в рецепторных клетках обонятельного эпителия, а также установлены предельно допустимые концентрации аммиака и сероводорода в воздухе рабочих помещений для некоторых отраслей промышленности.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты исследования докладывались на IV Всероссийской конференции «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 2005), Международном симпозиуме, посвященном 80-летию организации Института физиологии им. И.П. Павлова РАН «Механизмы адаптивного поведения» (Санкт-Петербург, 2005); XIII международном совещании и VI школе по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 2006); XIX Всероссийском научном совещании «Актуальные проблемы учения о тканях» (Санкт-Петербург, 2006); IV международном конгрессе «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине» (Санкт-Петербург, 2006); Международной конференции Atlanta 2006: Mastering the Mitochondrial Maze (Атланта, США, 2006); 14-th European Bioenergetic Conference (Москва, 2006); Международной конференции Chinese Mit’ 2006: Mitochondria and Health (Вэнжоу, Китай, 2006); Международной конференции «МЕТРОМЕД 2007» (Санкт-Петербург, 2007).

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, из которых 3 статьи в рецензируемых журналах и 10 тезисов докладов.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа содержит 134 страницы машинописного текста, иллюстрирована 4 таблицами и 14 рисунками. Список литературы включает 271 литературный источник, из которых 47 на русском языке и 224 – на иностранном.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Опыты проводили на изолированной обонятельной выстилке лягушки Rana temporaria. Для исследования флуоресценции комплекса: Ca2+-ХТЦ-КМ, а также НАДН и ФП обонятельную выстилку стимулировали струей увлажненного воздуха, содержащей насыщенные пары природной тертой d-камфоры (Реахим), цинеола (MP, США), амилового спирта (Реахим), ванилина (MP, США). Кроме того, изучали реакции обонятельной выстилки на 1 % раствор аммиака (Реахим) в дистиллированной воде и водный раствор -меркаптоэтанола (Fluka, Германия) в разведении 1:1000, выделяющего сероводород.

Интенсивность собственной флуоресценции НАДН и ФП в обонятельных клетках измеряли на установке для флуориметрического анализа, изготовленной на основе двулучевого люминесцентного микроскопа ЛЮМАМ-Р8. Флуоресценцию возбуждали на длине волны 365 нм, а регистрировали – на длине волны 465 нм (НАДН) и в области 520 – 530 нм (ФП) (Карнаухов, 1978). Одновременно записывали электроольфактограмму. Амплитуду реакций на одоранты оценивали по отношению изменения флуоресценции в ответ на подачу стимула (R) к уровню флуоресценции до воздействия одорантом (R0).

Динамику вторичной флуоресценции комплекса: Ca2+-ХТЦ-КМ изучали с помощью люминесцентного микроскопа ЛЮМАМ-МП. Флуоресценцию возбуждали ртутной лампой ДРШ-250М (max = 390 нм), свечение препарата регистрировали на 520 нм (Владимиров, Добрецов, 1980). Скорость нарастания начального линейного участка реакций комплекса: Ca2+-ХТЦ-КМ, а также НАДН и ФП считали как долю реакции (в %) от ее максимальной величины, достигаемую за 1 с (Hajnoczky et al., 1995).

При прижизненной телевизионной микроскопии одоранты добавляли непосредственно в раствор Рингера, омывающий обонятельную выстилку, в следующих концентрациях: ванилин 10-4 М, цинеол и камфора 10-5 М, амиловый спирт и аммиак 1:1000, -меркаптоэтанол 1:10000.

Фармакологический анализ проводили с использованием ротенона (MP, США) и малоната натрия (Sigma, США). Ротеноном (5 мкМ) ингибировали первый комплекс ДЦ митохондрий, а малонатом (50 мМ) – СДГ.

Достоверность различий оценивали с помощью программы Origin 7.5, применяя парный или независимый двухвыборочный t-тест (p = 0,05).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Все использованные в работе одоранты были разделены на две группы (Бигдай, 2004; Бигдай, Самойлов, 2004). В первую группу входили амиловый спирт, цинеол, камфора и ванилин, вовлекающие в рецепцию внутриклеточные сигнальные системы. Вторую группу составляли аммиак и -меркаптоэтанол, проникающие внутрь рецепторных клеток и действующие непосредственно на митохондрии.

Изучение кинетики флуоресценции комплекса: Ca2+-ХТЦ-КМ показало, что под действием амилового спирта, цинеола, камфоры и ванилина интенсивность флуоресценции возрастает. В результате исследования собственной флуоресценции НАДН и ФП было установлено, что интенсивность флуоресценции НАДН также увеличивалась под действием всех одорантов первой группы, тогда как свечение ФП усиливалось только под действием амилового спирта. Можно предположить, что увеличение интенсивности флуоресценции НАДН происходит в результате повышения снабжения ДЦ митохондрий восстановленными эквивалентами за счет активации Ca2+-зависимых дегидрогеназ цикла Кребса и СДГ.

Pages:     || 2 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»