WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 ||

Очистка продигиозина – органического вещества природного происхождения – сложная задача, так как бактериальный пигментный препарат является, по сути, пигментным комплексом, состоящим из множества фракций, кроме того, используемый способ выделения пигмента из бактериальной биомассы не исключает возможности одновременного извлечения из клеток и других соединений, в особенности соединений липидной природы. Известно, что пигмент связан с клеточной оболочкой, содержится в периплазматическом пространстве и/или на поверхности цитоплазматической мембраны [Vinas et al., 1983; Matsuyama et al., 1986], а, значит, может быть связан с некоторыми компонентами клеточной стенки. Поэтому приоритетной задачей при очистке пигмента было освобождение пигментного раствора от липидов и сопутствующих примесей. Необходимо учитывать нестабильную природу пигмента и подобрать наиболее щадящий метод очистки, приводящий к разделению пигментного препарата на минимальное количество основных фракций. Сложность применения высокотехнологичных методов очистки с жесткими условиями по отношению к продигиозину заключается в том, что этот вторичный метаболит чрезвычайно нестабилен даже в высокоочищенном состоянии и при хранении продолжает разделяться с появлением множества минорных фракций, которые обнаруживаются при рехроматографии уже очищенного пигмента [Walter et al., 1972]. Степень чистоты полученного нами в процессе очистки пигмента продигиозина анализировали с использованием метода ЯМР. Особые преимущества этого метода заключаются в том, что он позволяет однозначно определить число и расположение индивидуальных атомов в молекуле исследуемого вещества. Анализ ЯМР спектров пигмента продигиозина, молекулярная масса которого 323 Da достаточно прост, что объясняется небольшим количеством спектральных линий, вследствие небольшой его молекулярной массы. Общий анализ записанного спектра ЯМР позволяет сделать положительные выводы о чистоте полученного пигментного образца. Таким образом, разработанный способ очистки пигментного препарата позволяет достичь поставленной цели при незначительных материальных затратах и может быть использован для дальнейшей работы с пигментом продигиозином в лабораторных исследованиях.

Потенциальную экологическую и токсикологическую опасность пигмента необходимо установить для безопасного использования его в различных отраслях биотехнологии, медицине, сельском хозяйстве. Обработка растений бактериальной суспензией S. marcescens эффективна против таких возбудителей заболеваний, как Botrytis cinerea, Rhizoctonia solani [Someya et al., 2003; Someya et al., 2005]. Однако, факторы антагонистической активности S. marcescens изучены недостаточно. Предполагается, что таковыми являются ярко-красный пигмент продигиозин синтезируемый S. marcescens и комплекс хитинолитических ферментов секретируемых бактериями в среду. В некоторых работах отмечается, что продигиозин способен оказывать фунгицидное воздействие, которое наиболее явно проявляется лишь в присутствии хитинолитического комплекса ферментов. Конкурентное взаимодействие 2-х штаммов S. marcescens ATCC 9986 (пигментобразующий) и S. marcescens 24 (апигментный) с фитопатогенными микромицетами, показало возможность использования пигментобразующего штамма в качестве фунгицидного агента для защиты растений и сформировало представление о роли пигмента продигиозина, как основного фактора антагонистической активности продуцента. Анализ фунгицидной активности неочищенного пигментного препарата и очищенного пигмента позволил установить пропорциональную зависимость угнетения роста колоний фитопатогенных микромицетов от концентрации продигиозина. Возможность использования продигиозина S. marcescens в качестве нового фунгицидного агента должна рассматриваться с позиции безопасности его применения для сельскохозяйственных культур и условий окружающей среды. Мы установили, что эффективные концентрации продигиозина, как фитопротекторного вещества, находятся в диапазоне от 0.05 до 0.3 мкг/мл. В то же время авторы, предлагающие использовать продигиозин в качестве фунгицидного агента, указывают эффективные концентрации пигмента в пределах 1-100 мкг/мл [Someya et al., 1997; Someya et al., 2001]. Однако, применение пигмента для защиты растений, в указанных концентрациях не оправдано вследствие ингибирования продигиозином роста корней и способности растений накапливать биомассу, что показано в нашей работе.

Основными задачами данной работы были установление и изучение возможных токсических и генотоксических эффектов пигмента продигиозина. Цитотоксическое действие продигиозина установлено многими исследователями, при изучении противоопухолевого действия пигмента, на линиях раковых клеток [Montaner et al., 2000; Llagostera et al., 2005], при изучении фунгицидного потенциала продуцента Serratia marcescens [Someya et al., 2003; Someya et al., 2005]. Одним из современных и высокочувствительных методов изучения токсичности даже при очень низкой концентрации исследуемых веществ является тест на Paramecium caudatum. Результаты нашей работы подтверждают высокую чувствительность простейших к цитотоксическому действию продигиозина и сопоставимы с данными литературы, в которых также отмечается возможность применения этого пигмента для лечения протозойных инфекции [Melo et al., 2000]. Такие свойства пигмента могут объяснять его цитотоксическое действие в отношении бактерий и позволяют предполагать наличие у продигиозина генотоксического потенциала. Исследование мутагенной активности пигментного препарата на тестерном штамме S. typhimurium TA100 проводили в диапазоне концентраций 0.005 - 0.5 мкг/мл, что объясняется результатами предварительного изучения токсичности препаратов продигиозина. Неочищенный пигментный препарат в используемом диапазоне концентраций индуцирует генные мутации типа замены пар оснований в клетках S. typhimurium TA100. Обнаруженный эффект носит дозозависимый характер, однако он незначителен и свидетельствует о слабой мутагенной активности соединения [Фонштейн с соавт., 1985]. Очистка пигментного препарата снижает описанный мутагенный эффект до уровня фоновой частоты реверсий в негативном контроле. Таким образом, проявляемый генотоксический потенциал неочищенного пигментного препарата может быть связан с загрязняющими его компонентами, способными вызывать реверсию микроорганизмов опытного штамма к прототрофности. Метаболическая активация пигментных препаратов при использовании фракции S9 не способствует возникновению мутагенного эффекта в тесте Эймса. Возможно, что система монооксигеназ фракции S9 не способна трансформировать такое соединение как продигиозин, либо интермедиаты, образующиеся при его метаболизме не отличаются по степени своей генотоксичности от исходного соединения.

Наиболее распространенным методом изучения генотоксического потенциала соединений in vivo является учет микроядер в полихромных эритроцитах периферической крови мышей. Результаты изучения генотоксического потенциала продигиозина, представленные в данной работе, основываются на анализе 1350 НХЭ в контрольных образцах препаратов крови мышей, и опытных вариантах с различными концентрациями очищенного пигмента. Проведённое изучение генотоксичности продигиозина с использованием микроядерного теста показало незначительную индукцию микроядер в ПХЭ у обработанных животных. При этом дозозависимый эффект во всех используемых концентрациях отсутствовал. Таким образом, очищенный продигиозин в изученных концентрациях не является позитивным индуктором микроядер и не обладает существенным генотоксическим эффектом in vitro.

ВЫВОДЫ

  1. Штаммы Serratia marcescens ATCC 9986 и BKMБ-851 являются перспективными продуцентами продигиозина. Модифицированная среда Кинга А рекомендуется для получения продигиозина при использовании в качестве продуцентов штаммов Serratia marcescens ATCC 9986 и BKMБ-851.
  2. Применяемый в работе метод очистки пигментного препарата позволяет получить высокоочищенный продигиозин, что подтверждено методами тонкослойной хроматографии, ядерного магнитного резонанса и масс-спектрометрии.
  3. Продигиозин (0.1мкг/мл - 2мкг/мл) оказывает существенное токсическое воздействие на растения, выражающееся в ингибировании прорастания корней и накопления биомассы; на тестерный штамм Paramecium caudatum и фитопатогенные микромицеты родов Fusarium и Alternaria. Очистка продигиозина приводит к усилению его фунгицидного эффекта и фитотоксичности, но снижает токсический потенциал по отношению к простейшим.
  4. Результаты изучения генотоксичности очищенного продигиозина в тесте Эймса и микроядерном тесте на эритроцитах мышей позволяют причислить продигиозин к веществам с незначительной мутагенной активностью.
  5. Возможно использование продигиозина в качестве фунгицидного агента для защиты растений от фитопатогенных микромицетов в концентрациях от 0.05 мкг/мл до 0.1 мкг/мл, не оказывающих фитотоксическое воздействие.
  6. Препарат продигиозина может быть использован для маркирования различных нефтепродуктов, где его содержание определяется по интенсивности характерных спектральных линий в области длин волн =300...600нм при pH ниже 7, в отсутствие проявляющих реактивов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

  1. Гурьянов И.Д. Токсикологические эффекты продигиозина / И.Д. Гурьянов, Д.В. Юсупова // Ученые записки Казанского государственного университета. Сер. Естественные науки. – 2008. – Т.150, Кн. 2. – С. 120-125.
  2. Гурьянов И.Д. Очистка и характеристика пигментного препарата продигиозина / И.Д. Гурьянов, Д.В. Юсупова, В.В. Клочков, А.Р. Юльметов // Естественные и технические науки. – 2008. – №3 – С. 64-65.
  3. Гурьянов И.Д. Фитотоксические свойства продигиозина Serratia marcescens / И.Д. Гурьянов, Д.В. Юсупова // Защита и карантин растений. – 2008. – №4 – С. 58
  4. Гурьянов И.Д., Науменко Е.А. Токсикологические эффекты продигиозина Serratia marcescens / Казанск. гос. ун-т. – Казань, - 2007. – 9 с. – Деп. в ВИНИТИ 11.01.07, № 27.
  5. Юсупова Д.В. Способ идентификации маркированных нефтепродуктов / Д.В. Юсупова, Л.А. Габдрахманова, М.А. Куркина, И.Д. Гурьянов // Заявка на патент C10L1/00, C10M159/02, C10N30:20, Заявка № 2007135940/04(039293), с приоритетом от 27.09.07.
  6. Юсупова Д.В. Способ получения пигмента / Д.В. Юсупова, Л.А. Габдрахманова, И.Д. Гурьянов, М.А. Куркина, А.И. Албулов, М. А. Фролова, И.Г. Ермишина // Заявка на патент С10М159/02, С12 N 1/20, Заявка № 2007138501/13(042117), с приоритетом от 08.10.07.
  7. Рязанцева И.Н. Бактериальные пигменты в биотехнологии / И.Н. Рязанцева, И.Н. Андреева, Ч.Б. Медведева, Т.И. Огородникова, Н.Н. Валиева, И.Д. Гурьянов // Тез. докл. 2-я международная конференция «Наука-бизнес-образование биотехнология-биомедицина-окружающая среда». – Пущино, – 2005. – C.42.
  8. Иванчина Ю.В. Подбор условий оптимальных для биосинтеза пигмента продигиозина энтеробактериями Serratia marcescens / Ю.В. Иванчина, М.А. Куркина, И.Д. Гурьянов // Тез. докл. 10-я Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология наука XXI века». – Пущино, – 2006. – C.372.
  9. Гурьянов И.Д. Оптимизация питательных сред для получения пигмента продигиозина Serratia marcescens / И.Д.Гурьянов, М.А. Куркина // Тез. докл. XLV международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс». – Новосибирск, – 2007. – C.109-111.
  10. Гурьянов И.Д. Токсические и мутагенные эффекты бактериального пигмента продигиозина / И.Д.Гурьянов, Д.В Юсупова // Тез. докл. региональной научно-практической конференции «Синтез и перспективы использования новых биологически активных соединений». – Казань, – 2007. – C.73-75.
  11. Куркина М.А. Разработка эффективной биотехнологии получения бактериального пигмента продигиозина / М.А.Куркина, И.Д. Гурьянов, Д.В. Юсупова // Тез. докл. VII научная конференция молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра КГУ «Материалы и технологии XXI века». – Казань, – 2007. – C.67.
Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 ||






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»