WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

Продигиозин, как фактор антагонистической активности S. marcescens. При посеве методом встречных культур А. sambaticum и S. marcescens ATCC 9986, Fusarium solani и S. marcescens ATCC 9986 выявлено значительное ингибирование роста фитопатогенного микромицета с ярко выраженной зоной лизиса (рис. 8). Факторы фунгицидной активности S. marcescens ATCC 9986 не влияли на рост колонии Fusarium sp. Штамм S. marcescens 24 (апигментный) не проявлял антагонистическую активность в отношении микромицетов, используемых в опыте.

Рис. 8. Антагонистическая активность S. marcescens ATCC 9986 по отношению к F. solani: А – контроль - рост F. solani, Б – совместное культивирование F. solani с пигментобразующим штаммом S. marcescens ATCC 9986.

Добавление в питательную среду НПП или очищенного пигмента продигиозина в ряду концентраций 0.1, 0.5, 1.0 мкг/мл приводило к ингибированию роста патогенных микромицетов (рис.9).

Рис.9. Фунгицидное действие очищенного пигментного препарата по отношению к Fusarium sp. А – контроль (рост колонии Fusarium sp. на КГА), Б – рост колонии Fusarium sp. на среде с концентрацией продигиозина 0.1мкг/мл, В – 0.5мкг/мл, Г - 1мкг/мл.

Таким образом, проведенные исследования показали, что фактором антагонистической активности S. marcescens является продигиозин.

Токсическое воздействие препаратов продигиозина на прорастание семян и накопление биомассы растений. Результаты работы по установлению токсического влияния НПП и очищенного пигмента продигиозина на прорастание семян растений представлены в таблице (табл. 3).

Таблица 3

Токсическое влияние продигиозина на прорастание семян

Концентра-

ция, мкг/мл

ингибирование роста корней, %

кукуруза

горох

неочищенный пигментный препарат

очищенный пигмент

неочищенный пигментный препарат

очищенный пигмент

2

1

0,5

0,2

0,1

98.6±1.6

97.5±2.0

82.0±3.3

13.0±2.8

4.2±2.0

100

100

94.0±1.8

21.5±3.1

8.0±2.3

94.0±2.0

93.0±3.0

75.0±3.5

11.7±2.4

3.6±1.1

98.2±1.5

96.0±3.4

88.0±3.0

16.0±3.17

5.7±1.8

Характерно, что очистка продигиозина приводит к возрастанию его токсического воздействия на прорастание корней растений. Эти результаты косвенно подтверждаются особенностями токсического влияния препаратов продигиозина на способность растений накапливать биомассу (рис. 10).

Рис. 10. Ингибирование (% от контроля) накопления биомассы растением при суточной экспозиции семян в растворе с различной концентрацией пигмента (0.05, 0.1, 0.5, 1 мкг/мл)

Определение острой летальной токсичности на тест-объекте Paramecium caudatum. Наиболее токсичным оказался неочищенный пигментный препарат, который уже при концентрации 0.009 мкг/мл вызывал 50% гибель инфузорий, а в концентрации 0.046 мкг/мл данное соединение вызывало гибель 90-100% особей тест-объекта. Наименее токсичным оказался очищенный пигментный препарат, LD50 которого установлена для концентрации 0.05 мкг/мл (табл. 4).

Таблица 4.

Смертность Paramecium caudatum (% от контроля) при действии неочищенного пигментного препарата (НПП) и очищенного продигиозина (ОП)

концентрация, мкг/мл

смертность, %

НПП

ОП

0

0

0

0.01

56.5±3.4

18.0±1.6

0.05

100

49.5±2.7

0.1

100

100

Токсические эффекты продигиозина по отношению к бактериям. Токсический эффект определяли по выживанию тестерного штамма S.typhimurium TA100 в опытных вариантах по сравнению с контрольным. Продигиозин обладал сильным токсическим действием по отношению к тестерному штамму в концентрациях 1 мкг/мл и выше. Эти данные были учтены при изучении генотоксичности пигментных препаратов.

Индукция генных мутаций пигментными препаратами в тесте Эймса. Результаты исследования мутагенной активности пигментного препарата на штамме S.typhimurium TA100 без метаболической активации представлены на рисунках (рис. 11, 12).

Рис. 11. Мутагенное действие различных концентраций (0.05, 0.1, 0.5 мкг/мл) НПП и ОП в тесте Эймса без метаболической активации. К – негативный контроль (количество колоний ревертантов при спонтанной реверсии), NaN3 - позитивный контроль (количество колоний ревертантов на среде с добавлением азида Na в концентрации 10 мкг/чашку).

Рис. 12. Мутагенное действие различных концентраций (0.05, 0.1, 0.5 мкг/мл) НПП и ОП в тесте Эймса с метаболической активацией. К – негативный контроль (количество колоний ревертантов при спонтанной реверсий).

Мутагенность оценивали по превышению количества ревертантов в опыте над контролем. Для НПП в тесте Эймса без метаболической активации это превышение составило 5.25 раз при концентрации 0.5мкг/мл, 4.5 и 3.0 раза в концентрациях 0.1 и 0.05 мкг/мл соответственно. В варианте опыта с метаболической активацией количество ревертантов на среде с 0.5 мкг/мл НПП снизилось до 4.8 раз по сравнению с контролем, в 4.12 и 3.1 раза в концентрациях 0.1 и 0.05 мкг/мл.

Таким образом, тест Эймса показал слабую мутагенную активность неочищенного пигментного препарата продигиозина в ряду концентраций 0.5 – 0.1 – 0.05 мкг/мл. Очищенный продигиозин не проявил мутагенной активности во всех вариантах опыта.

Микроядерный тест на эритроцитах периферической крови мышей in vivo. Анализ 1350 нормохромных эритроцитов (НХЭ) в контрольных образцах препаратов крови мышей, и опытных вариантах с различными концентрациями очищенного продигиозина проводился с целью установления отношения НХЭ к полихромным эритроцитам (ПХЭ), которое отражает уровень хромосомных повреждений и генотоксический потенциал исследуемых соединений. Частота встречаемости ПХЭ в контрольном образце, на 48 час проведения опыта, была равна 4-8, что несколько выше данных литературы. Отбор пробы контрольного образца еще через 24 часа, показал идентичные результаты – количество микроядер в периферической крови мышей не увеличилось. Результаты анализа влияния опытных концентраций очищенного продигиозина на частоту образования ПХЭ представлены в таблице (табл. 5).

Таблица 5

Влияние продигиозина на частоту образования ПХЭ в периферической крови мышей

концентрация, мкг/кг веса животного

количество ПХЭ

48ч.

72ч.

0 (негатив. контроль)

5.8±1.9

5.6±2.1

4

6.7±2.3

6.6±1.5

8

6.3±1.7

7.3±1.7

25

5.0±1.2

3.6±1.5

1.5 (колхицин)

15.4±1.1

22.3±0.9

Таким образом, проведённое изучение генотоксичности продигиозина с использованием микроядерного теста показало незначительную индукцию микроядер в ПХЭ у обработанных животных и отсутствие дозозависимого эффекта во всех используемых концентрациях. Очищенный продигиозин в изученных концентрациях не является позитивным индуктором микроядер и не обладает существенным генотоксическим эффектом in vivo.

Маркирование нефтепродуктов продигиозином и способ идентификации маркированных нефтепродуктов.

Нами разработан способ идентификации маркированного нефтепродукта, основанный не на измерении поглощения нефтепродукта только в одной точке, при длине волны = 535 nm, а на снятии всего оптического спектра маркированного бензина в области длин волн = 300-600 нм, без добавления проявителя. Немаркированный нефтепродукт при аналогичных условиях исследования демонстрирует отсутствие спектра поглощения в данной области (рис. 13). Предлагаемый нами способ идентификации делает возможным идентификацию маркированного нефтепродукта в условиях потока вещества.

А Б

Рис. 13. Спектр бензина АИ 92: A - немаркированного бензина, Б – маркированного; контроль немаркированный бензин.

Спектры маркированных бензинов А 76, АИ 95, АИ98 и дизельного топлива производства «Татнефть», авиационный бензина и авиационный керосина аналогичны спектру АИ 92. Во всех маркированных образцах бензинов и керосина в области длин волн = 300-600 нм наблюдается ярко выраженный пик, характерный для спектра пигмента.

Хранение в течение 6 месяцев не оказывало существенного влияния на маркированные бензины.

Обсуждение результатов

Эффективность биотехнологического производства, связанного с использованием микроорганизмов в первую очередь определяется правильным подбором штаммов-продуцентов продуктов производства, а также оптимальностью условий биосинтеза. Кроме того, важным критерием является сравнительная дешевизна сырья для приготовления питательной среды. Решающее значение для жизнедеятельности продуцентов имеют набор и соотношение компонентов среды культивирования (качество сырья, отношение С:N, содержание примесей). S. marcescens является прототрофным организмом и может расти на средах с единственным органическим источником углерода. Для получения пигмента S. marcescens в литературе предложены разнообразные среды [King et al.,1954; Williams et al., 1961,1971; Трутко, Акименко,1989; Kats, Sobleski,1979; Chang et al., 2000; Giri et al., 2004]. На сегодняшний день относительно дешевой и экономически выгодной является пептон-глицериновая среда, содержащая всего 5г пептона и 20г глицерина на 1 л. Однако поиски высокопродуктивных штаммов и дешевых питательных сред проводятся широким фронтом и в настоящее время [Chang et al., 2000; Giri et al., 2004; Tao et al., 2005; Oller, 2006]. Направление исследований перспективно и может снизить стоимость препарата. Большинство рекомендуемых сред содержит дорогостоящий пептон, который необходимо заменить каким-либо более дешевым аналогом, способным обеспечить соизмеримый биосинтез продигиозина.

Разработанная питательная среда (модифицированная среда Кинга А, в которой пептон (20 г/л) заменен гидролизатом коллагена в концентрации 5 г/л), обеспечивает хороший рост и высокий выход пигмента при использовании рекомендуемых штаммов-продуцентов (S. marcescens ATCC 9986 и ВКМБ-851). Использование штамма S. marcescens ATCC 9986 и модифицированной питательной среды (5 г/л гидролизата коллагена), удешевляет получение продигиозина в 5 раз. Мы предполагаем, что отношение источника азота к источнику углерода 2:1 (в среде Кинга А) не оптимально для роста и синтеза продигиозина S. marcescens. По мере уменьшения концентрации гидролизата коллагена в среде достигается соотношение источника азота и углерода, равное 1:2, что более благоприятно для биосинтеза продигиозина.

Pages:     | 1 | 2 || 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»