WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Жидкостная хроматография. Жидкостную хроматографию проводили на стеклянной колонке общим объемом 628 см3 с использованием силикагеля марки КСК. Однородную суспензию сорбента готовили из расчета 5 г силикагеля на 20-30 мл смеси гексан – ацетон 90:10 (об/об). После наполнения колонки уровень растворителя опускали до верхней границы столбика силикагеля и дважды промывали смесью гексан – ацетон 90:30 (об/об). Раствор пигмента в этаноле наносили на поверхность сорбента. Колонку промывали следующими растворителями: 350 мл смеси гексана с ацетоном в соотношении 90:30 (об/об), 200 мл ацетона. Скорость движения подвижной фазы (растворителя) в колонке 0.03 мл/сек. Все полученные фракции были по отдельности собраны и проанализированы.

Тонкослойная хроматография (ТСХ). Тонкослойную хроматографию проводили на стеклянных пластинках для препаративного разделения, с силикагелем марки 60 F254 (Merck, Германия). Смесь для разделения: гексан – этиловый эфир – уксусная кислота в соотношении 70:30:1 (об/об/об). Для количественной и качественной характеристики измеряли величины Rf полученных полос, затем их по отдельности снимали с пластин вместе с сорбентом и последовательно элюировали следующими растворителями: 96% этанол, ацетон, хлороформ.

Хроматографические полосы анализировали с использованием реактивов для определения фосфолипидов: 0.5% раствор родамина B в этаноле, реактив Драгендорфа, нингидрин, пары йода [Хроматография в тонких слоях, 1965].

Каждый этап очистки завершали анализом оптических спектров поглощения полученных фракций в ультрафиолетовой и видимой областях спектра.

Физико-химические методы анализа очищенного пигмента продигиозина. ЯМР спектр на ядрах 1H записывали на ЯМР спектрометре Bruker Avance II (500 MHz), с использованием в качестве растворителя дейтерированного хлороформа (CDCl3).

Анализ оптических спектров поглощения полученных в работе фракций продигиозина проведен с использованием двулучевого спектрофотометра Lambda 35 (Perkin Elmer instruments, США) в диапазоне длин волн 200…700 нм. Масс-спектрометрию проводили на приборе ВПМС МХ-5303 (ИАП РАН, Россия).

Оценку антагонистической активности Serratia marcescens по отношению к фитопатогенным микромицетам проводили с использованием метода встречных культур на картофельно-глюкозном агаре (КГА).

Фунгицидная активность препаратов продигиозина. Сравнение фунгицидной активности неочищенного пигментного препарата (НПП) и очищенного пигмента проводили посевом исследуемого микромицета на КГА с добавлением различных концентраций пигмента. Контролем служил рост грибов на среде без продигиозина.

Методы оценки токсичности

Токсическое влияние препаратов продигиозина на рост корней растений. Оценку токсического влияния продигиозина на рост корней растений проводили по модифицированному методу ISO 11269-1 [ISO 11269-1, 1993].

Оценку влияния препаратов продигиозина на накопление биомассы растений осуществляли с использованием метода рекомендованного Международной организацией стандартизации по протоколу ISO 1269-2 [ISO 1269-2, 1993].

Определение острой летальной токсичности на тест-объекте Paramecium caudatum. проводили согласно методу, разработанному на кафедре микробиологии КГУ [Наумова с соавт., 2000].

Тест на токсичность по отношению к Salmonella typhimurium проводили согласно [Ильинская, Маргулис, 2005].

Методы оценки генотоксичности

Полуколичественный метод учета генных мутаций (тест Эймса) проводили по стандартной процедуре [Ames, Lee, 1973]. Учет результатов проводили по индукции обратных мутаций к гистидиновой прототрофности через 48ч. инкубации. Сравнивали число колоний-ревертантов в опыте и контроле.

Микроядерный тест на эритроцитах периферической крови мышей in vivo. Опытные концентрации продигиозина (25, 8, 4 мкг/кг) вводили мышам подкожно. Образцы крови из хвостовой вены животного отбирались через 48, 72 ч после введения исследуемых концентраций. Препараты окрашивали красителем Романовского-Гимза.

Маркирование и идентификация маркированных нефтепродуктов. В работе использовали бензины различных марок, дизельное топливо производства «Татнефть», авиационный бензин и авиационный керосин, которые маркировали этанольным раствором продигиозина. С целью идентификации маркированных нефтепродуктов снимали оптический спектр поглощения в области длин волн =350…600 нм на регистрирующем спектрофотометре Lambda 35 (Perkin Elmer instruments, США).

Статистическая обработка результатов. Математическую обработку данных проводили в стандартной компьютерной программе "Microsoft Excel". Группу данных считали однородной, если среднеквадратическое отклонение в группе не превышало 13%. Различие между группами считали достоверным при критерии вероятности р 0.05.

Результаты исследования

Сравнительная характеристика роста и пигментообразования исследуемых штаммов S. marcescens. Среди 22-х изученных представителей вида S. marcescens наибольшие количества продигиозина образовывали два штамма S. marcescens ATCC 9986 и S. marcescens BKMБ-851, которые были отобраны для дальнейших исследований. Остальные пигментообразующие штаммы синтезировали незначительные количества продигиозина. Результаты проведенной работы позволяют рекомендовать штаммы S. marcescens ATCC 9986 и S. marcescens BKMБ-851 в качестве перспективных продуцентов продигиозина.

Образование продигиозина при культивировании бактерий на различных средах. Рост и пигментообразование отобранных штаммов изучали на трех средах, рекомендованных ранее для получения продигиозина: среда Кинга А, пептон-глицериновая и овсяная. Наибольшее накопление биомассы происходило на среде Кинга А. При этом штамм S. marcescens BKMБ-851 отличался более интенсивным ростом. Штамм S. marcescens ATCC 9986 менее интенсивно накапливал биомассу на среде Кинга А, но синтезировал значительно большее количество пигмента. На среде Кинга А биосинтез продигиозина штаммом S. marcescens ATCC 9986 был в четыре раза выше чем на пептон-глицериновой среде (рис. 1).

Рис. 1 Сравнительная характеристика роста и пигментообразования штаммов S. marcescens ATCC 9986 и BKMБ-851 на питательных средах: 1 – среда Кинга А, 2 – пептон-глицериновая (ПГС), 3 –овсяная среда; А – биомасса; Б – пигмент; В – продуктивность.

В связи с высокой стоимостью данных питательных сред была предпринята попытка заменить в них пептон на гидролизат коллагена или кукурузный шрот. Замена пептона на гидролизат коллагена в среде Кинга А приводило к стимуляции роста обоих штаммов. При этом у штамма S. marcescens BKMБ-851 общий выход пигмента увеличивался в 8 раз, достигая своего наибольшего значения при концентрации гидролизата коллагена 5 г/л (рис.2). Аналогично увеличивалось накопление биомассы. Модификация пептон-глицериновой среды путем замены пептона на гидролизат коллагена (5 г/л) стимулировала рост штаммов, увеличивала общий выход продигиозина, и увеличивала продуктивность штамма S. marcescens BKMБ-851. Продуктивность штамма S. marcescens ATCC 9986 не увеличивалась. При использовании кукурузного шрота наблюдался слабый рост бактерий, пигментообразование отсутствовало.

Рис. 2 Рост и биосинтез продигиозина штаммами S. marcescens ATCC 9986 и BKMБ-851 на модифицированной среде Кинга А: 1 – с добавлением гидролизата коллагена в количестве 20г/л, 2 – 10г/л, 3 – 5г/л; А – биомасса; Б – пигмент; В – продуктивность.

Оптимальными условиями для биосинтеза продигиозина отобранными штаммами на модифицированной среде Кинга А были следующие: продолжительность культивирования – 48 ч, количество инокулята – 2% от объема среды, температура - 28±0.2С, аэробные условия. Продигиозин не выделяется в среду и локализован в поверхностных структурах клетки. С целью подбора менее трудоемкого и более эффективного метода экстракции пигмента из клеток сравнивали различные методы экстракции (табл. 1). Наиболее результативным оказался метод экстракции пигмента из клеток этанолом без предварительной обработки клеток щелочью.

Таблица 1.

Влияние метода экстракции пигмента из клеток на выход продигиозина

метод экстракции

биомасса, г

пигмент, мкг

%

1

Разрушение клеток кипячением с NaOH, с последующей экстракцией пигмента этанолом

4.4

189

100

2

Экстракция пигмента этанолом без предварительной обработки клеток

4.4

259

156±7

3

Экстракция пигмента подкисленным этанолом без предварительной обработки клеток

4.4

240

147±6

4

Экстракция пигмента изопропанолом без предварительной обработки клеток

4.4

240

147±6

Выделение и очистка пигментного препарата продигиозина, его характеристика. Неочищенный пигментный препарат (НПП) в подкисленном этаноле имел типичный для продигиозина спектр поглощения в видимой области в кислых и щелочных условиях (рис. 4).

Рис. 4. Оптические спектры поглощения неочищенного пигментного препарата в этаноле: А – при pH 3.0, Б – при pH 9.0.

На колонке с силикагелем пигмент делился на три основные фракции: желто-оранжевую, красную и сиреневую, спектры поглощения которых представлены на рисунке (рис.5).

Рис. 5. Оптические спектры поглощения фракций, полученных при хроматографии неочищенного пигментного препарата на колонке: 1 - желто-оранжевой, 2 - красной (с максимумом поглощения 535 нм и плечом 485 – 515 нм), 3 - сиреневой (с максимумом поглощения 488-500 нм).

Для проведения дальнейшей очистки с использованием ТСХ была отобрана красная фракция, которая на пластинках с силикагелем также разделялась на три вышеуказанные фракции с описанными характеристиками (сиреневая - Rf = 0.058, красная - Rf = 0.312, желто-оранжевая - Rf = 0.824). Таким образом, выход интересующей нас красной фракции пигмента в процентном соотношении от используемого в процессе очистки пигментного препарата составил величину – 7.6% (табл. 2).

Таблица 2

Выделение и очистка препарата продигиозина

Этапы очистки

Количество продигиозина, мг/л

Выход, %

Этанольный экстракт

0.64

100

Колоночная хроматография

0.22

34.2

Тонкослойная хроматография

0.05

7.6

Красная фракция пигмента была отобрана как наиболее соответствующая нативному пигменту продигиозину и проанализирована с использованием методов ТСХ, масс-спектрометрии и ЯМР-спектрометрии (рис. 6, 7), что позволило подтвердить принадлежность данной фракции к продигиозину и детектировать её чистоту.

Рис. 6. Масс-спектр красной фракции пигмента (Mr полученной фракции 322,9 Da).

Рис. 7. ЯМР-спектр очищенного пигментного препарата. ЯМР-химические сдвиги продигиозина были следующими: 0.92 p.p.m., 1.31 p.p.m., 1.33 p.p.m., 1.60 p.p.m, 2.40 p.p.m., 2.55 p.p.m., 4.00 p.p.m., 6.08 p.p.m., 6.35 p.p.m., 6.68 p.p.m., 6.99 p.p.m., 7.27 p.p.m., 7.55 p.p.m.

Проявление хроматографических пластинок после опрыскивания раствором нингидрина, реактивом Драгендорфа, раствором родамина В и экспозиции в йодной камере показало общее наличие фосфатидов и, в частности, аминофосфатидов в НПП и их отсутствие в пигментном образце, прошедшем все этапы очистки.

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»