WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 |

На правах рукописи

ГУРЬЯНОВ Иван Дмитриевич

БИОСИНТЕЗ, ОЧИСТКА И ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ ПРОДИГИОЗИНА ПИГМЕНТА SERRATIA MARCESCENS

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Казань – 2008

Работа выполнена на кафедре микробиологии Казанского государственного университета им. В. И. Ульянова-Ленина

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник

Юсупова Дельбэр Вафовна

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук, профессор Госманов Рауис Госманович

(Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н. Э. Баумана,

г. Казань)

доктор биологических наук, профессор Морозов Николай Васильевич

(Татарский государственный гуманитарно-педагогический университет, г. Казань)

Ведущая организация:

Институт биологии УНЦ РАН, г. Уфа

Защита диссертации состоится «25» сентября 2008 г. в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 212.081.08 при Казанском государственном университете по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, д. 18, главное здание, ауд. 211.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Н. И. Лобачевского при Казанском государственном университете.

Автореферат разослан « » августа 2008 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук З. И.  Абрамова

Актуальность проблемы. Большинство работ, в области изучения бактериальных пигментов посвящено фототрофам, в то время как пигменты нефотосинтезирующих микроорганизмов изучены в значительно меньшей степени. Ярко-красный пигмент продигиозин, синтезируемый энтеробактериями Serratia marcescens, представляет собой линейный трипиррол (пиррол, 3-метоксипиррол, 2-метил-3-амилпиррол). Как и многие вторичные метаболиты бактерий, продигиозин приобретает практическое значение в промышленности и медицине. В промышленности продигиозин рекомендуется в качестве красителя для полимеров, поскольку он обладает рядом преимуществ по сравнению с применяемыми в настоящее время органическими и неорганическими пигментами. Разработан способ использования продигиозина для маркирования нефтепродуктов [Гарейшина с соавт., 2003]. Пигмент хорошо растворим в различных марках топлива и легко обнаруживается по характерному спектру поглощения. Продигиозин и продигиозинподобные пигменты, синтезируемые некоторыми видами микроорганизмов, рассматриваются как новое семейство противоопухолевых лекарственных препаратов [Montaner et al., 2000; Llagostera et al., 2005]. Показано, что продигиозин действует, как иммунодепрессант, селективно блокируя пролиферацию Т-клеток киллеров [Han et al., 1998; Azuma et al., 2000], избирательно индуцирует апоптоз различных типов злокачественных клеток [Montaner, Prez-Toms, 2001; Camps et al., 2003], ингибирует образование метастаз, обладает антиинвазивными свойствами [Prez-Toms et al., 2003].

В связи с большой практической значимостью продигиозина возникает необходимость в наработке больших количеств пигмента и снижении его стоимости. Высокая стоимость пигмента тормозит, в частности, использование его в качестве маркера нефтепродуктов. Кроме того, неизученным остается вопрос о мутагенности, генетической токсичности продигиозина. Для изучения этих свойств необходимы высокоочищенные препараты продигиозина. В представленной работе предполагается разработать эффективную схему получения продигиозина и изучить некоторые биологические эффекты пигмента.

Цель и задачи исследований. Цель данной работы состояла в следующем: разработать эффективную схему получения бактериального пигмента продигиозина; определить его токсические и генотоксические свойства и установить возможности практического применения. В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

  • подобрать высокопродуктивные по биосинтезу пигмента продигиозина штаммы Serratia marcescens, оптимизировать питательную среду и условия культивирования для получения продигиозина в лабораторных и полупромышленных масштабах;
  • получить и охарактеризовать высокоочищенный пигментный препарат с привлечением физико-химических методов;
  • установить токсичные и безопасные концентрации продигиозина для растений, простейших и микроорганизмов;
  • определить мутагенные свойства препаратов продигиозина с использованием основных методов генетической токсикологии;
  • определить возможность применения пигмента в качестве фунгицидного агента для защиты растений от фитопатогенных микромицетов;
  • оценить возможность и перспективность использования продигиозина в качестве биологического маркера нефтепродуктов и разработать более точный метод идентификации маркера.

Научная новизна. Проведена сравнительная оценка токсичности пигментных препаратов по отношению к прокариотическим и эукариотическим организмам. Получены приоритетные данные о генотоксических эффектах продигиозина. Показано отсутствие генотоксического воздействия очищенного продигиозина в тесте Эймса и микроядерном тесте in vivo. Определены антагонистические свойства продигиозина в отношении фитопатогенных микромицетов. Оценка возможности применения пигмента в качестве фунгицидного агента для защиты растений проведена с учетом определения эффективной и безопасной концентрации продигиозина.

Практическая значимость. Разработана дешевая, простая в приготовлении питательная среда для культивирования Serratia marcescens – штамма-продуцента продигиозина, способствующая высокому выходу пигмента. Разработан метод получения высокоочищенного пигментного препарата. С учетом использования продигиозина в различных отраслях биотехнологии (красителя полимеров, маркера нефтепродуктов) результаты, полученные в данной работе, позволяют определить возможную экологическую опасность при попадании пигмента и связанных с ним продуктов производства в окружающую среду. Выявленная фунгицидная активность продигиозина, как одно из проявлений токсического эффекта, может служить аргументом в пользу разработки методов применения данного препарата для защиты сельскохозяйственных растений от фитопатогенов. Упрощенный метод идентификации продигиозина и хорошая растворимость в различных марках топлива позволяют рекомендовать пигмент в качестве маркера нефтепродуктов.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Исследования автора по тематике диссертационной работы поддержаны федеральными программами «Развитие научного потенциала высшей школы» РНП.2.1.1.1005, РНП.2.1.1.3222. Грант АН РТ, № 03-3.5-33/ 2006 (Г) 2006 г. Индивидуальный грант КГУ (2008). Научные положения диссертации и выводы базируются на результатах собственных исследований автора. Масс-спектроскопические исследования проведены в лаборатории ИОФХ им. Арбузова. Микроядерный тест проведен в лаборатории ИОФХ им. Арбузова.

Положения, выносимые на защиту:

1. Разработана эффективная схема получения продигиозина; с применением хроматографических методов получен и охарактеризован препарат продигиозина высокой степени очистки.

2. В тестах in vitro и in vivo впервые установлены особенности генотоксического влияния продигиозина, определена возможность возникновения мутаций в клетках Salmonella typhimurium TA 100 и индукции хромосомных повреждений эритробластов у млекопитающих.

3. Установлены антагонистическая активность штамма Serratia marcescens ATCC 9986 и фунгицидная активность продигиозина. Определены эффективные нетоксичные концентрации пигмента при использовании продигиозина для защиты растений.

4. Разработан и рекомендуется к применению новый способ идентификации нефтепродуктов, маркированных пигментом.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на: 2-й международной конференции «Наука-бизнес-образование биотехнология-биомедицина-окружающая среда» (Пущино, 2005), 10-й Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология наука XXI века» (Пущино, 2006), XLV международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2007), Региональной научно-практической конференции «Синтез и перспективы использования новых биологически активных соединений» (Казань, 2007), Научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра КГУ «Материалы и технологии XXI века» (Казань, 2007), I международной практическая конференция «Микробная биотехнология – новые подходы и решения» (Казань, 2007).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 научных работ.

Благодарности. Автор выражает огромную благодарность своему научному руководителю к.б.н. Юсуповой Дельбэр Вафовне за предоставление интересной темы диссертационной работы и научное руководство. Автор также благодарит: Клочкова В.В. за проведение ЯМР-спектроскопии, Карамову Н.С. и Маргулис А.Б. за помощь в освоении методов генетической токсикологии.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 142 страницах, содержит 8 таблиц и 44 рисунка и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследований, обсуждения результатов, выводов, списка литературы, включающего 163 источников, из них 133 на иностранном языке и приложения.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Объекты исследования. Оптимизацию питательных сред и определение высокоэффективных продуцентов пигмента, проводили с использованием штаммов Serratia marcescens, полученных из различных коллекций. Оценку антагонистической активности, проводили с использованием пигментобразующего штамма S. marcescens АТСС 9986 и апигментного его варианта, полученного отбором посевного материала из стабильно непигментирующих колоний. В тесте на токсичность по отношению к микроорганизмам и в тесте Эймса использовали мутантный штамм Salmonella typhimurium ТА100 – his G46, rfa, uvr, bio, pKM101. В качестве тест-объектов при определении антагонистического спектра, а также исследовании фунгицидной активности препаратов продигиозина использовали следующие культуры фитопатогенных грибов: Fusarium sp., Fusarium solani, Alternaria alternarium, Alternaria sambaticum из коллекции НИЛ ББФ Казанского университета. Токсическое влияние продигиозина на рост корней и накопление биомассы растений проводили с использованием высушенных цельных семян гороха, кукурузы, ячменя и овса, предоставленных «ТатНИИСХ». Определение острой летальной токсичности проводили с использованием в качестве тест-объекта монокультуры Paramecium caudatum, выделенной из активного ила очистных сооружений предприятия «Казаньоргсинтез».

Условия культивирования, питательные среды. В работе использовали пептон производства Семипалатинского мясокомбината, содержащий Pi в количестве 0.8 мг/% [Знаменская с соавт., 1982], гидролизат коллагена Щелковского биокомбината, кукурузный глютен (шрот) производства ООО “Рыбфлотпром”, г. Калининград. Бактерии культивировали на жидких и агаризованных питательных средах (среда Кинга А [King et al., 1954] (г/л): пептон - 20, глицерин - 10, K2SO4 - 10, MgCl2 - 1.4, pH 7.6-7.9; среда Кинга А, с заменой пептона гидролизатом коллагена в количестве - 20; 10; 5.0; 2.5 г/л; пептон-глицериновая среда [Katz, 1979] (г/л): пептон - 5, глицерин - 20, pH 7.6; пептон-глицериновая среда, с заменой пептона гидролизатом коллагена в количестве 5.0; 2.5 г/л; овсяная среда [Юсупова с соавт., 1983] (г/л): пептон - 10, галактоза - 1, овсяная мука - 4, NaCl - 5, pH 7.6-7.9). В жидких средах бактерии культивировали в конических колбах (отношение объема среды к объему колбы 1:5), на качалке (200 об/мин) при температуре 28-30С в течение 48-72 ч. Культивирование бактерий на агаризованных питательных средах проводили при одинаковых условиях с учетом размеров чашек Петри и объема сред в них. Скорость роста культуры определяли по изменению оптической плотности культуральной жидкости и веса сухой биомассы. Полученную биомассу бактерий заливали 1N раствором NaOH в отношении 1:2 к объему питательной среды, из которой были собраны бактерии. Суспензию клеток кипятили на водяной бане в течение 1 часа. Пигмент экстрагировали 98% этанолом или подкисленным этанолом, или этанолом без предварительного добавления 1N раствора NaOH и кипячения, в соотношении 1:2 к объему среды суспензии, встряхивая на качалке при 200 об/мин. в течение 3-х часов. Повторную экстракцию проводили до полного обесцвечивания осадка. Выход продигиозина пересчитывали на 1л среды или к величине сухой биомассы.

Определение количества продигиозина. Количество пигмента рассчитывали с использованием удельного коэффициента поглощения, который при = 535 нм составляет величину 51.5103 см2/мг [Williams et al., 1971], на спектрофотометре Lambda 35 (Perkin Elmer instruments, США). Для этого полученный спиртовой экстракт пигмента разводили подкисленным этанолом (9 мл этанола + 1мл 1N HCl).

Получение продигиозина и его экстракционная очистка. Для получения пигмента продигиозина штамм-продуцент S. marcescens АТСС 9986 культивировали на агаризованной пептоно-глицериновой среде (ПГС). Экстракцию продигиозина из биомассы бактерий проводили кислым этанолом (100мл 96% этилового спирта + 1мл HClконц.), до полного обесцвечивания биомассы. Полученный препарат высушивали на воздухе и повторно элюировали. Процедуру повторяли несколько раз до освобождения от нерастворимых примесей. Полученный однородный раствор был обозначен, как неочищенный пигментный препарат (НПП) и использован для маркирования нефтепродуктов (в качестве маркера).

Очистка пигментного препарата. Этанольный экстракт выпаривали в вакуумном шкафу при температуре 45-500С и перерастворяли пигмент в хлороформе. Полученный раствор смешивали с равной по объему водно-этанольной смесью (объемное соотношение этанол-вода - 1:4) и эмульгировали на магнитной мешалке в течение 1ч. От водорастворимых примесей и водно-этанольной смеси освобождались на делительной воронке. Процедуру повторяли, увеличив объемное соотношение этанола вдвое. Затем пигментный препарат повторно высушивали в вакуумном шкафу и перерастворяли в этаноле.

Pages:     || 2 | 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»