WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 |

Согласно нашей гипотезе, в силу высокой электрофильности молекулы ТНТ она способна к одноэлектронному восстановлению за счет неспецифических редуктантов, в том числе, ассоциированных с компонентами клеточной поверхности, содержащих ионы металлов с переменной валентностью (таких как железо или марганец). Присутствие переходных металлов на поверхности бактериальных клеток может быть обусловлено различными механизмами: в клетки бактерий железо из окружающей среды может транспортироваться низкомолекулярными хелатирующими агентами – сидерофорами, связывающими Fe (III) [Raymond 1994, Eisendle et al., 2004], другим механизмом поглощения железа из внеклеточной среды служит восстановление хелатированного Fe (III) на поверхности клетки с участием редуктаз плазматической мембраны [Georgatsou, Alexandraki, 1994; Georgatsou, Alexandraki, 1999]. Совокупность приведённых данных позволила предположить существование редокс-цикла с участием ТНТ и кислорода. Образующийся при одноэлектронном восстановлении нитроанионный радикал нестабилен и реокисляется кислородом с образованием супероксид-аниона и регенерацией исходного соединения (рис.13).

Рис. 13. Предполагаемая схема внеклеточного редокс-цикла, функционирующего на начальном этапе трансформации ТНТ аэробными бактериями.

В случае мертвых клеток данный шунт не сопряжен с дальнейшей трансформацией ТНТ по традиционному пути восстановления его нитрогрупп, независимо от присутствия глюкозы как потенциального донора электронов.

Показанное нами совместное присутствие О2•– и •ОН на поздних этапах трансформации ТНТ клетками B. cereus ZS-18 вероятнее всего является следствием вторичного образования гидроксильного радикала в реакции Фентона. Но нельзя не принимать во внимание существование иного механизма формирования •ОН, основанного на взаимодействии металла активного центра СОД с Н2О2, что было показано методом ЭПР [Yim et al., 1990].

В числе немногих примеров индуцированного ксенобиотиками образования микроорганизмами внеклеточного супероксид-аниона известна продукция данного радикала при взаимодействии клеток Escherichia coli с гербицидом паракватом [Hassan, Fridovich, 1978, Carr et al., 1986]. Другой гербицид – 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д) – известен как индуктор апоптоза [Kaioumova et al., 2001], а также ассоциирован с лимфомой и другими видами рака [Tuschl, Shwab, 2003]. Прооксидантный эффект данного соединения показан при использовании дрожжей Saccharomyces cerevisiae в качестве экспериментальной эукариотической модели [Teixeira et al., 2004]. Токсические эффекты муравьиной кислоты, широко применяемой в современной химической промышленности, также связывают с образованием свободных радикалов [Dikalova et al., 2001].

Предпринятое нами изучение формирования АФК при взаимодействии бактериальных клеток с другими ароматическими соединениями (ТНБК, ТНФ, 2,4-ДНТ, 2,6-ДНТ), а также метаболитами ТНТ (2-АДНТ, 4-АДНТ), проявляющими токсический эффект по отношению к различным тест-объектам, не выявило присутствия свободных радикалов в течение всего времени инкубации. В совокупности с вышесказанным данный феномен позволяет сделать вывод о том, что в случае ТНТ имеет место одноэлектронное восстановление молекулы ксенобиотика с вовлечением кислорода в данный процесс, нехарактерное для других нитроароматических соединений.

Принципиальная возможность одноэлектронного восстановления ТНТ в литературе прогнозируется некоторыми авторами в связи с реакцией, катализируемой «кислород-чувствительной» нитроредуктазой, исходным донором электронов для которой является NAD(P)H, а разобщение двухэлектронного потока происходит на уровне флавинов. В результате этого процесса предполагается образование нитроанионного радикала, который может являться предшественником нитрозодинитротолуола, но может быть окислен молекулярным кислородом с регенерацией исходного ксенобиотика и образованием О2•– [Spain, 1995; Esteve-Nez et al., 2001]. Нами показана возможность принципиально иного механизма внеклеточной генерации О2•– непосредственно при контакте микробных клеток с ТНТ за счет неферментативного редокс-превращения, ассоциированного с клеточной поверхностью с участием ионов металлов с переменной валентностью. Существование такого редокс-цикла подтверждается тем, что взаимодействие не только живых, но и мёртвых бактериальных клеток с ТНТ приводило к появлению О2•– во внеклеточном пространстве. Более того, небиологическая трансформация ТНТ при взаимодействии с желтой кровяной солью также сопровождалось генерацией О2•–.

Обнаруженная в нашей работе внеклеточная аккумуляция О2•– на раннем этапе микробной трансформации ТНТ представляет интерес в связи с высокой токсичностью данного радикала, которая проявляется в окислении липидов мембран, а также фрагментации ДНК, в развитии воспаления, в повреждении сосудов [Halliwell, Gutteridge, 1984; Huycke,et al., 2002]. Данные эффекты частично связаны с собственной токсичностью О2•–, одним из проявлений которой служит ингибирование ключевых ферментов клетки [Carlioz, Touati, 1986], Fe-S-содержащих белков, но основную роль, вероятно, играет образование вторичных, более активных форм кислорода, в том числе Н2О2 и •ОН.

Поскольку обнаруженное нами образование супероксида клеточными суспензиями при контакте с ТНТ является общим для репрезентативных представителей родов Bacillus, Lactobacillus и Pseudomonas, вполне вероятно, что микрофлора человека и высших животных, подвергающихся воздействию данного ксенобиотика, также способствует внеклеточному образованию супероксидного радикала, что может вносить решающий вклад в проявление токсических и генотоксических эффектов ТНТ.

Для более широкого обоснования концепции вовлечения кислорода в процесс трансформации ТНТ с образованием АФК мы изучали взаимодействие с данным ксенобиотиком культивируемых клеток растений как модели высших эукариот. Применение асептических каллусных культур для изучения ТНТ-трансформирующей активности позволяет исключить участие микроорганизмов, а также связывания ксенобиотика с гумусовыми соединениями в почве. Использованная нами культура клеток гречихи татарской трансформировала ТНТ по пути восстановления нитрогрупп с образованием ГАДНТ в качестве ранних метаболитов, что является важным аргументом в пользу универсальности основного механизма конверсии ксенобиотика как прокариотами, так и эукариотами. Следует, однако, отметить, что наблюдалась более глубокая трансформация нитроарила, приводящая к накоплению моноаминопроизводных в качестве основных метаболитов при продолжительной инкубации растительных клеток в присутствии ТНТ, что может быть связано с наличием большего по сравнению с бактериальными клетками пула восстановительных эквивалентов, а также разнообразием ферментативных систем редуктазной направленности.

Растения часто подвергаются общему физиологическому стрессу, неотъемлемой составляющей которого является окислительный стресс. Культивируемые растительные клетки испытывают влияние окислительного стресса в процессе роста в нормальных условиях на поздних стадиях развития культуры [Zhao et al., 2005], а также под влиянием ряда факторов среды и условий культивирования [Cassels, Curry, 2001]. Кислородные радикалы образуются в растительных клетках in vivo и in vitro как побочные продукты нормального окислительного метаболизма. Изучение изолированных плазматических мембран различных растений, в том числе обработанных элиситорами, выявило NADPH-супероксид-синтазную активность [Auh and Murphy, 1995]. Контакт суспензии культивируемых растительных клеток с ТНТ в нашем эксперименте приводил значительному повышению уровня образования АФК по сравнению с наблюдаемым в культуре независимо от воздействия ксенобиотика. Таким образом, ТНТ по отношению растениям может рассматриваться как индуктор окислительного стресса.

Ввиду высокой реакционной способности АФК нельзя исключать возможности нарушений поверхностных структур клетки за счет взаимодействия со свободными радикалами. Показанное нами с применением метода флуоресцентного окрашивания увеличение проницаемости поверхности клеток различного эволюционного уровня при взаимодействии с ТНТ мы связываем с генерацией АФК, сопутствующей метаболически не опосредованной и опосредованной трансформации данного ксенобиотика клетками про- и эукариот. Нарушение проницаемости мембранных структур, вероятно, связано с реакцией перекисного окисления липидов, которая играет важную роль в развитии клеточной патологии [Владимиров, Арчаков, 1972; Владимиров, 2000].

Таким образом, вероятной причиной изменений в проницаемости мембраны как бактериальных, так и растительных клеток является генерация АФК, в частности, супероксида, который способен атаковать жирнокислотные цепи фосфолипидов, содержащие сопряженные двойные связи, с образованием гидрофобных радикалов, взаимодействующих друг с другом.

ВЫВОДЫ

  1. Из различных источников обитания выделены и идентифицированы три репрезентативных штамма микроорганизмов, трансформирующих 2,4,6-тринитротолуол по пути нитроредукции с образованием гидроксиламинодинитротолуолов в качестве основных метаболитов
  2. Впервые показано, что для штаммов с различными типами метаболизма характерно образование активных форм кислорода на начальном этапе трансформации 2,4,6-тринитротолуола. Более поздние этапы нитроредукции ТНТ штаммом Bacillus cereus ZS18 сопряжены со вторичным образованием гидроксильного радикала, что нехарактерно для штамма Pseudomonas putida EN1582. В процессе же трансформации 2,4,6-тринитротолуола клеточной суспензией Lactobacillus plantarum IL1 в системе обнаруживался исключительно гидроксильный радикал
  3. Увеличение концентрации 2,4,6-тринитротолуола и количества интактных клеток приводило к усилению генерации супероксидного анион-радикала. Зависимость концентрации детектируемого супероксида от количества термически инактивированных клеток отсутствовала
  4. Трансформация 2,4,6-тринитротолуола суспензией растительных клеток Fagopyrum tataricum происходит по механизму нитровосстановления и сопряжена с усилением фонового уровня оксидативного стресса в культуре
  5. Контакт клеток различного уровня организации с 2,4,6-тринитротолуолом приводит к изменению их физиологических свойств, что выражается в увеличении проницаемости мембран, замедлении роста колоний бактерий и гибели каллусных клеток в культуре растительной ткани

Список работ, опубликованных по теме диссертации

  1. Зиганшин А. М. Гидридное восстановление 2,4,6-тринитротолуола дрожжами – путь к его глубокой деструкции / А. М. Зиганшин, А. В. Наумов, Е. С. Суворова, Е. А. Науменко, Р. П. Наумова // Микробиология. – 2007. – Т. 76, № 6. – С. 766–773.
  2. Науменко Е. А. Участие кислорода в бактериальной трансформации 2,4,6-тринитротолуола / Е. А. Науменко, А. В. Наумов, Е. С. Суворова, Р. Герлах, А. М. Зиганшин, А. П. Ложкин, Н. И. Силкин, Р. П. Наумова // Биохимия – 2008. - Т 73, №4. – С. 568-575
  3. Науменко Е. А. Образование активных форм кислорода в процессе аэробной трансформации 2,4,6-тринитротолуола бактериями / Е. А. Науменко, А. В. Наумов, А. М. Зиганшин, А. П. Ложкин, Н. И. Силкин, Р. П. Наумова; Казан. гос. ун-т. – Казань, 2006. – 20 с. – Деп. в ВИНИТИ 27.12.2006, № 1617-B2006.
  4. Науменко Е.А. Начальные продукты трансформации 2,4,6-тринитротолуола грамположительными и грамотрицательными микроорганизмами // в сборнике научных трудов Международного биотехнологического центра МГУ. - М.: Спорт и Культура, - 2004. – С. 54-55.
  5. Костычева Ю.Ф. К вопросу о ремедиации почв, загрязнённых взрывчатыми веществами / Ю.Ф. Костычева, А.М. Зиганшин, Е.А. Науменко, А.В. Наумов // Тез. докл. науч. конф. «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии». – М: Макс Пресс, - 2004. – С.101-102.
  6. Костычева Ю.Ф. Метаболический блок на пути трансформации 2,4,6-тринитротолуола. / Ю.Ф. Костычева, С.А. Зарипов, Е.А. Науменко, Р.П. Наумова // Тез. докл. 8-й Пущинской школы-конф. молодых учёных «Биология – наука ХХI века». - Пущино- 2004. -с.151.
  7. Науменко Е.А. Токсикологические аспекты микробной трансформации 2,4,6-тринитротолуола // В сб. науч. студ. работ «Биотехнология – охране окружающей среды» - М: Графикон-принт, - 2005. – С.339-341.
  8. Науменко Е.А. Оценка острой токсичности экологически опасных нитросоединений в тесте MICROTOX TM / Е.А. Науменко, А.П. Ложкин, А.М. Зиганшин, Р.П. Наумова // Доклады Московского общества испытателей природы. – 2006.- т.39, - с.238.
  9. Зиганшин А.М. Механизмы метаболической активации и детоксикации экологически опасных нитроароматических ксенобиотиков / А.М. Зиганшин, Е.А. Науменко, А.П. Ложкин, Р.П. Наумова // В сб. статей Росс. школы-конф. молодых учёных «Экотоксикология: современные биоаналитические системы, методы и технологии». – Пущино-Тула – 2006. –С.70-72.
  10. Зиганшин А.М. Восстановление ароматического кольца 2,4,6-тринитротолуола дрожжами – обитателями нефтезагрязнённых почв и нефтешламов / А.М, Зиганшин, А.И. Гиндуллин, Е.А. Науменко, Р.П. Наумова // Доклады Московского общества испытателей природы. – 2006.- т.39, - с.220.
  11. Сырова А.В. Оценка токсичности экологически опасных нитроароматических ксенобиотиков / А.В. Сырова, Е.А. Науменко, А.П. Ложкин // Тез. докл. международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов – 2007». – Москва – 2007. –с.118-119.
  12. Хиляс И.В. Микроорганизмы-деструкторы химических загрязнения осадков и почв / И.В. Хиляс, Е.А. Науменко // Тез. докл. международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов – 2007». – Москва – 2007. – с.123.
  13. Naumenko E.A. Generation of superoxide in 2,4,6-trinitrotoluene microbial transformation / E.A. Naumenko, A.P. Lozhkin, A.M. Ziganshin, R.P. Naumova, N.I. Silkin // Abstracts of the international conference “Modern development of magnetic resonance” – Kazan – 2007. – p.213-214.
  14. Зиганшин А.М. Гидроксиламины как основные метаболиты трансформации 2,4,6-тринитротолуола / А.М. Зиганшин, Е.А. Науменко, А.П. Ложкин, А.Н. Крицкая, Р.П. Наумова // Тез. докл. 9-й Пущинской школы-конф. молодых учёных «Биология – наука ХХI века». - Пущино- 2005. -с.102.
  15. Науменко Е.А., Динамика токсичности в процессе биотрансформации 2,4,6-тринитротолуола / Е.А. Науменко, А.П. Ложкин, А.М. Зиганшин, Р.П.
    Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»