WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |
  1. Образование АФК в процессе трансформации ТНТ

Феномен «недыхательного» потребления кислорода и его масштабы позволили предположить участие активных форм кислорода в трансформации ТНТ. Действительно, анализ образования О2•– с применением реакции супероксид-зависимого превращения эпинефрина в адренохром свидетельствовал о немедленном образовании данного радикала после внесения бактериальных клеток в инкубационную смесь, содержащую ТНТ (рис.4).

Рис. 4. Динамика образования супероксида А – в процессе трансформации ТНТ (100 мг/л) клеточной суспензией B. cereus ZS18; Б – то же, что А, но с добавлением 400 ед/мл СОД.

В качестве более специфичного и чувствительного метода определения генерации АФК использовали ЭПР-спектроскопию с применением двух спиновых ловушек: Tiron и DMPO, переводящих чрезвычайно нестабильные радикалы кислорода в относительно более стабильную форму. С целью определения специфичности данных ловушек применительно к О2•– и •ОН, а также для получения стандартных ЭПР-спектров использовали модельные реакции образования свободных радикалов – ксантиноксидазную реакцию и реакцию Фентона.

Выявлено, что как Tiron, так и DMPO при взаимодействии с реакционной смесью, содержащей О2•–, образуют ЭПР-детектируемые спиновые аддукты: Tiron-семихинон и DMPO-ООН, соответственно, которые имеют характерные спектры (рис.5).

Рис. 5. Эталонные ЭПР-спектры аддуктов спиновых ловушек с О2•– Tiron-семихинона (А) и ДМПО-ООН (Б).

Спиновые аддукты ловушек с •ОН также обладают определенными характеристиками ЭПР-линий (рис.6).

Рис. 6. Эталонные ЭПР-спектры аддуктов спиновых ловушек с •ОН: Tiron-•ОН (А) и ДМПО-OH (Б).

Сопоставление эталонных спектров с регистрируемыми в системе ТНТ+бактериальные клетки показало, что начальный этап трансформации ТНТ действительно сопряжен с генерацией О2•–, который неизменно регистрировали в любых вариантах ТНТ+клетки при использовании спиновых ловушек. Продукция супероксида начиналась непосредственно в момент внесения суспензии клеток в ТНТ-содержащий фосфатный буфер. В большинстве случаев концентрация О2•– была максимальной через 15-60 мин от начала инкубации и достигала 15-20 мМ. Полная конверсия ТНТ в ГАДНТ приводила к прекращению генерации О2•–. Оказалось, что термическая обработка клеток, использованная нами для исключения участия ферментов в изучаемых процессах, не предотвращала образования АФК, хотя приводила к резкому снижению их уровня по сравнению с живыми клетками (рис.7).

Рис. 7. ЭПР-спектры аддуктов спиновых ловушек с О2•–, записанные А – через 15 мин после внесения интактных клеток B. cereus ZS18 в фосфатный буфер, Б – то же, что А, но при концентрации ТНТ 100 мг/л, В – то же, что Б, но после внесения термически инактивированных клеток, Г – то же, что Б, но спектр записан через 180 мин после внесения клеток.

Изучение зависимости уровня образования О2•– в начальный момент времени от концентрации ТНТ выявило, что в диапазоне концентраций 25-100 мг/л имела место пропорциональная зависимость уровня генерации О2•– от концентрации ксенобиотика, в то время как повышение концентрации от 100 до 150 мг/л проявлялось лишь в незначительном увеличении концентрации супероксида.

При варьировании клеточной плотности суспензии живых клеток и клеток, инактивированных термическим воздействием наблюдали усиление ЭПР-сигнала при повышении клеточной плотности живых клеток, тогда как изменение количества мертвых клеток не позволяло выявить пропорциональную зависимость.

Анализ эталонных спектров спиновых аддуктов и их сравнение с регистрируемыми в процессе трансформации ТНТ клетками B. cereus ZS18, выявил сочетание в одном спектре ЭПР-линий, характерных для Tiron-семихинона и аддукта Tiron с •ОН. Это позволило сделать вывод, что в изучаемой нами системе имеет место генерация О2•– и вторичное образование •ОН. Следует отметить, что совместное присутствие О2•– и •ОН было характерно для поздней стадии инкубации клеток в растворе ТНТ (60-120 мин), тогда как в течение первых 15 мин в системе определялся исключительно О2•– (рис.8).

Рис. 8. ЭПР-спектр аддуктов Tiron- АФК, записанный в процессе трансформации ТНТ штаммом B. cereus ZS18 через 60 мин после внесения клеток.

* – линии ЭПР, соответствующие О2•–.

В процессе трансформации ТНТ другим модельным штаммом, P. putida EN1582, также имело место образование О2•–. Следует отметить, что уровень генерации О2•– в данной системе был выше, чем в случае трансформации ТНТ клетками B. cereus ZS18. При этом вторичное образование •ОН не наблюдалось даже на более поздних этапах трансформации ТНТ (рис.9).

Рис. 9. ЭПР-спектры аддуктов Tiron- О2•–, записанные в процессе трансформации ТНТ штаммом P. putida EN1582 через 60 мин после внесения клеток.

Изучение генерации АФК в процессе трансформации ТНТ клетками L. plantarum IL-1 не выявило образования супероксида. Спектры ЭПР, регистрируемые в данной системе относились исключительно к аддуктам Tiron с •ОН (рис.10).

Рис. 10. ЭПР-спектр аддукта Tiron-•ОН, записанный в процессе трансформации ТНТ штаммом L. plantarum IL-1

Обращает на себя внимание, что контакт бактериальных клеток с другими нитроароматическими соединениями (ТНБК, ТНФ, 2,4ДНТ), а также стабильными метаболитами нитроредукции ТНТ (2АДНТ, 4АДНТ), внесенными в систему в концентрации, эквивалентной молярному содержанию ТНТ, не приводил к образованию кислородных радикалов, что было зафиксировано с привлечением ЭПР-спектроскопии по отсутствию характерных спектров аддуктов спиновых ловушек.

  1. Образование АФК в процессе трансформации ТНТ культивируемыми клетками F. tataricum

Для культуры каллусных клеток гречихи татарской было характерно образование некоторого фонового уровня АФК независимо от взаимодействия с ТНТ. Однако контакт культивируемых клеток с ТНТ в условиях клеточной суспензии приводил к достоверному повышению этого уровня. При этом, в отличие от суспензии бактериальных клеток, совместное образование О2•– и •ОН в суспензии каллусных клеток было характерно уже для раннего этапа инкубации.

  1. Влияние хелатирующих агентов на биотрансформацию ТНТ и образование АФК

C целью выяснения роли клеточной поверхности и, в частности, структур, содержащих ионы металлов с переменной валентностью, в снижении концентрации ТНТ и в образовании О2•–, была предпринята обработка клеток B. cereus ZS18 хелатирующими агентами (ЭДТА и 2,2`-бипиридилом) перед их внесением в ТНТ-содержащую инкубационную смесь. Обработка клеток как ЭДТА, так и бипиридилом, приводила к торможению трансформации ТНТ. и значительно снижала уровень продукции супероксида (рис.11).

Рис. 11. Влияние хелатирующих агентов на уровень образования О2•– в системе клетки B. cereus ZS18 + ТНТ

  1. Небиологическая трансформация ТНТ ферроцианидом (K4[Fe(CN)6])

Внесение K4[Fe(CN)6] в фосфатный буфер с ТНТ способствовало немедленному снижению концентрации ксенобиотика на 15% в течение первых 15 мин трансформации. Далее происходило восстановление концентрации ТНТ практически до исходного значения. При этом образование каких-либо продуктов восстановления ТНТ, детектируемых методом ВЭЖХ, не наблюдалось.

Взаимодействие данного комплексного соединения с ТНТ приводило к образованию красной кровяной соли (K3[Fe(CN)6]), что было определено спектрофотометрически по поглощению при 340 нм. ЭПР-спектроскопия показала генерацию О2•–, уровень которого был сравним с таковым, регистрируемым при трансформации ТНТ бактериальными клетками (рис.12).

Рис. 12. ЭПР- спектр Tiron-семихинона, записанный через 15 мин после инициации трансформации ТНТ K3[Fe(CN)6].

  1. Оценка физиологического состояния клеток методом флуоресцентного окрашивания

С использованием лазерной конфокальной флуоресцентной микроскопии в нашем эксперименте удалось показать, что уже через 2 мин экспозиции бактериальных клеток в фосфатном буфере с ТНТ происходят их функциональные изменения, связанные с изменением проницаемости мембран, что было выявлено по окрашиванию клеток PI. Флуоресцентная микроскопия, проведенная после конверсии 50% ТНТ в ГАДНТ, также выявила изменения проницаемости мембран либо нарушение их целостности. Таким образом, контакт бактериальных клеток с ТНТ в условиях клеточных суспензий приводит к усилению их проницаемости, что, безусловно, может быть связано с образованием АФК.

Что касается культивируемых клеток гречихи татарской, то наблюдаемая картина была аналогичной: контакт каллусных клеток с ТНТ в концентрации 50 мг/л приводил к окрашиванию 100% ядер PI.

  1. Определение жизнеспособности клеток B. cereus и F. tataricum культуральным методом

Несмотря на то, что клетки, подвергнутые воздействию ТНТ, проявляли признаки изменения проницаемости клеточных мембран или нарушения их целостности, они не теряли способности к формированию колоний при посеве на оптимальную питательную среду. При этом наблюдалось замедление роста, которое может быть связано с тем, что клеткам, имеющим изменения в мембране, для перехода к размножению необходимо репарировать эти нарушения. Полученные данные позволяют говорить о бактериостатическом эффекте ТНТ, который, безусловно, связан с нарушением проницаемости клеточных мембран, которое успешно преодолевается клетками при росте на богатой питательной среде. Наблюдаемый эффект ТНТ по отношению к бактериям, вероятно, связан с генерацией АФК и сопутствующими изменениями липидных структур мембран.

Сравнение способности к регенерации каллусной ткани клетками, подвергнутыми воздействию ТНТ, с контролем (клетками, суспендированными в фосфатном буфере без ТНТ) показало, что контакт растительных клеток с ТНТ в течение 2 ч приводит к их гибели. Следовательно, трансформация большей части ТНТ каллусными клетками происходит уже после прекращения их жизнеспособности.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ТНТ относится к наиболее широко распространённым компонентам взрывчатых смесей, применяемых со времени первой мировой войны. Токсический, мутагенный и канцерогенный потенциалы данного соединения были выявлены с привлечением тест-организмов различного эволюционного уровня от бактерий до млекопитающих [Амерханова, Наумова, 1979; Wyman et al., 1992; Bruns-Nagel, 1996; Frishe, Hoper, 2003; Saka, M., 2004; Lachance, 2004]. С учетом реальных масштабов загрязнения тринитротолуолом почв и водных ресурсов, большое значение имеет изучение механизмов развития токсических проявлений при контакте с данным ксенобиотиком, а также прогнозирование его поведения в природных сферах и в организме человека.

Ранее в качестве первых стабильных метаболитов данного соединения обнаруживались, как правило, аминодинитротолуолы (АДНТ). ГАДНТ впервые были обнаружены методом ВЭЖХ в качестве основных метаболитов ТНТ у микромицета Phanerochaete chrysosporium [Michels, Gottshalk, 1994]. В дальнейшем эти продукты четырехэлектронного восстановления нитрогруппы ТНТ оказались его ключевыми метаболитами у широкого круга грамположительных и грамотрицательных бактерий [Наумов с соавт., 1998; Зарипов с соавт., 2004].

Предпринятое нами измерение концентрации ТНТ в момент контакта бактериальных клеток с данным соединением (в условиях инкубации клеточных суспензий с ТНТ) выявило его закономерную убыль (4-9% от исходной дозы). Согласно результатам манометрических опытов, потребление кислорода при инкубации клеточных суспензий возрастает (до 1.5 – 2 раз) в варианте клетки + ТНТ по сравнению с уровнем эндогенного окисления в варианте без ТНТ. Это позволило предположить, что контакт клеток с ТНТ сопровождается генерацией АФК. Действительно, методом ЭПР-спектроскопии с использованием Tiron и DMPO в качестве спиновых ловушек, а также колориметрическим методом на основе превращения эпинефрина в адренохром мы обнаружили образование О2•– с последующим его преобразованием в •ОН.

Образование АФК, а также моментальный характер ответной реакции в начале контакта клеток с ТНТ позволили предположить ее неферментативную природу, аргументом в пользу которой служат и результаты опытов с мёртвыми клетками, а именно, убыль около 20% исходного ТНТ в сочетании с появлением сигнала ЭПР.

Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»