WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |

Трансформация ТНТ клеточными суспензиями бактерий. Бактерии предварительно культивировали до поздней экспоненциальной фазы роста. Клетки осаждали центрифугированием (9000g, 15 мин), дважды отмывали 30мМ Na2HPO4 / 20 мМ KH2PO4 (рН 7.0) и ресуспендировали в ТНТ-содержащем буфере до оптической плотности (А600) 0.1; 0.5 или 1.0. В опытах с мертвыми клетками отмытую клеточную суспензию предварительно выдерживали в водяной бане (1000С, 15 мин). С целью определения влияния хелатирующих агентов на процесс трансформации ТНТ клетки отмывали буфером, содержащим ЭДТА или 2,2`-бипиридил. ТНТ вносили перед автоклавированием до конечной концентрации 100 мг/л.

Трансформация ТНТ клеточными суспензиями каллусной ткани. Каллус предварительно культивировали на агаризованной среде RX [Румянцева с соавт., 1998]. Каллусные культуры поддерживали в термостате при температуре 26+ 20С, в темноте, на каллусогенной среде RХ, рН 5.5 – 5.6. Для получения клеточной суспензии каллусную массу переносили с агаризованной среды RX в 50мМ K-Na фосфатный буфер (рН 7.0), содержащий ТНТ. Инкубировали при 250С в аэрируемых условиях.

Трансформация ТНТ ферроцианидом (K4[Fe(CN)6]). Реакцию инициировали внесением K4[Fe(CN)6]*3H2O (10-2мМ) в 50мМ фосфатный буфер, содержащий ТНТ (100 мг/л). Об образовании феррицианида (K3[Fe(CN)6]) судили по увеличению поглощения при 320 нм.

Высокая эффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) продуктов трансформации ТНТ. ВЭЖХ-анализ в освобождённых от клеток инкубационных смесях проводили на хроматографе Series 200 (Perkin Elmer, США), в обращенно-фазовом варианте с использованием колонки (150 х 4.60 мм C18, Phenomenex) с детектором длин волн при 254 нм. Элюцию проводили в изократическом режиме системой растворителей ацетонитрил-вода (40:60) при скорости 0.5 мл/мин и температуре 300С.

Определение потребления кислорода клеточными суспензиями. Потребление кислорода определяли манометрическим методом Варбурга. Потребление О2 инкубационными смесями с плотностью бактериальной суспензии А600= 2.0 измеряли в том же буфере при концентрациях ТНТ 50 и 100 мг/л.

Определение активных форм кислорода (АФК)

Определение супероксидного анион-радикала (О2•) адренохромным методом. К 2 мл освобождённой от клеток инкубационной жидкости добавляли 200 мкл 0.1% водного раствора гидрохлорида эпинефрина и после 15-минутной инкубации проводили измерения при 480 нм против освобожденной от клеток неокрашенной инкубационной жидкости на спектрофотометре Lambda 35 (Perkin Elmer, США).

ЭПР-спектрометрия АФК. ЭПР-спектры супероксида регистрировали на спектрометре ESP-300 (Bruker, Германия), при комнатной температуре (~25°C), СВЧ мощность 50 мВт, СВ частота 9.8 ГГц, амплитуда ВЧ модуляции 0.5 Гаусс. Tiron (50 мМ) добавляли к исследуемым растворам после отделения клеток, рН доводили до 9.5-10. Образцы в объеме 20 мкл помещали в стеклянные капилляры. Образование О2•– и гидроксильного радикала (•ОН) регистрировали также с применением спиновой ловушки DMPO при следующих параметрах ЭПР-спектрометрии: комнатная температура (~25°C), СВЧ мощность 20 мВт, модуляция поля 100 кГц, амплитуда ВЧ модуляции 1.0 Гаусс, константа времени 164 мсек. Аутентичные (эталонные) спиновые аддукты получали, применяя модельные системы образования АФК. Для генерации О2•– использовали ксантин-ксантиноксидазную реакцию. ОН генерировали в реакционной системе Фентона.

Определение физиологического статуса бактериальных и растительных клеток в процессе трансформации ТНТ

Определение клеточной проницаемости методом флуоресцентного окрашивания. Флуоресцентную микроскопию бактерий и клеток каллусной культуры проводили с применением конфокального лазерного флуоресцентного микроскопа LSM 510 Meta (Carl Zeiss, Германия). Определение физиологического состояния растительных и бактериальных клеток в процессе трансформации ТНТ проводили с использованием двойного окрашивания двумя флуоресцентными красителями: пропидиум иодидом (PI) и 4,6-диамидино-2-фенилиндол дигидрохлоридом (DAPI) [Shi et al., 2007]. Полученные изображения анализировали с помощью компьютерной программы Carl Zeiss Advanced Imaging Microscopy 4.0.

Определение жизнеспособности клеток культуральными методами. Для определения способности бактериальных клеток, подвергнутых воздействию ТНТ, к пролиферации проводили их высев на МПА на различных этапах трансформации ТНТ. Учет КОЕ и диаметра колоний проводили через 24, 48 и 72 ч. Способность к размножению культивируемых растительных клеток, взаимодействовавших с ТНТ, изучали высевом на агаризовнную среду RX отфильтрованных клеток, отобранных через 2 мин и 2 ч после начала трансформации ТНТ. Через 7 сут определяли уровень прироста сырой биомассы каллуса. Рост суспензионной культуры гречихи татарской в присутствии различных концентраций ТНТ проводили в темноте в условиях принудительной аэрации. Уровень прироста биомассы измеряли через 7 сут культивирования.

Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку результатов исследований осуществляли с использованием стандартного пакета Microsoft Office Excel 2007. Обработку данных ЭПР-спектроскопии проводили в программной среде Origin 7.5. Результаты представлены в виде средних значений со стандартными отклонениями (М±m). В экспериментах по флуоресцентному окрашиванию клеток представлены репрезентативные данные. Для оценки статистической значимости различий между опытной и контрольной выборками использовали критерий Стьюдента, принимая р0.05 за достоверный уровень значимости.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

  1. Выделение и идентификация микроорганизмов

Источниками выделения бактериальных штаммов, осуществляющих преимущественно восстановление нитрогрупп, служили почва, нефтехимические шламы и кисломолочные продукты. Были отобраны 3 штамма, однонаправленно трансформирующих ТНТ по пути нитроредукции с образованием изомерных ГАДНТ в качестве мажорных метаболитов, способные к росту при высоких концентрациях ТНТ (100-200 мг/л). На основании физиолого-биохимических признаков данные штаммы были предварительно отнесены к родам Bacillus (Bacillus sp. ZS 18), Pseudomonas (Pseudomonas sp. EN1582) и Lactobacillus (Lactobacillus sp. IL1). Для определения видовой принадлежности выделенных штаммов была проведена их идентификация с применением методов молекулярной биологии на основе анализа нуклеотидной последовательности 16S рДНК, комплементарной 16S рРНК.

Секвенирование проводили по стандартной процедуре согласно протоколу фирмы Beckman. Результаты сравнения установленных нуклеотидных последовательностей 16S рДНК изучаемых штаммов с последовательностями базы данных GenBank и RibosomalDataBaseProjectII позволили с вероятностью 89-99% идентифицировать штамм Bacillus sp. ZS18 как Bacillus cereus, штамм Pseudomonas sp. EN1582 как Pseudomonas putida, штамм Lactobacillus sp. IL-1 как Lactobacillus plantarum.

  1. Трансформация ТНТ интактными бактериальными клетками

Скрининг ряда грамположительных и грамотрицательных штаммов показал, что внесение клеточной массы в инкубационную смесь или ростовую среду сопровождается убылью некоторого количества ТНТ. Это начальное снижение (в пределах 4-9 мг/л) могло быть связано либо с сорбцией ТНТ бактериальными клетками, либо с его трансформацией в пределах соответствующих концентраций. Отделение клеток от инкубационных смесей с последующей экстракцией эфиром или хлороформом не выявили присутствия ТНТ, связанного с клетками.

Проведенный ВЭЖХ-анализ инкубационных смесей после отделения клеток выявил в качестве основных метаболитов изомерные ГАДНТ. Причем, в случае L. plantarum IL-1 и P. putida EN1582 имело место практически стехиометрическое превращение ТНТ в ГАДНТ, не сопровождающееся образованием моноаминопроизводных в течение всего времени эксперимента (3 ч). Начальный этап трансформация ТНТ B. cereus ZS18 также не был сопряжен с образованием АДНТ, но после второго часа инкубации происходило дальнейшее восстановление ксенобиотика с появлением моноаминопроизводных в инкубационной смеси. При этом концентрации 4АДНТ была незначительной и составляла 6.5-8.3 мкМ (рис.1).

Рис. 1. ВЭЖХ инкубационной смеси при трансформации ТНТ (440 мкМ) интактными клетками Bacillus cereus ZS18 через 3 ч после начала инкубации.

  1. Трансформация ТНТ термически инактивированными бактериальными клетками

Моментальная убыль некоторого количества ТНТ непосредственно после внесения клеток, позволила предполагать неферментативную природу начального этапа его трансформации бактериями. Для подтверждения данного предположения необходимо было испытать инактивированные бактериальные клетки, неспособные к росту на питательных средах.

Внесение в инкубационную смесь нежизнеспособных, термически инактивированных клеток B. cereus ZS18 способствовало менее масштабному, чем в варианте с интактными клетками, однако закономерному снижению концентрации ТНТ (рис.2).

Рис. 2. Динамика убыли ТНТ в процессе инкубации клеток B. cereus ZS18 (А600=1.0) в фосфатном буфере с ТНТ (100 мг/л): 1 – живые клетки + ТНТ; 2 – термически инактивированные клетки + ТНТ; 3 – ТНТ без клеток.

Характерно, что в процессе продолжительной инкубации таких клеток с ксенобиотиком обычно детектируемые с применением ВЭЖХ-анализа метаболиты, такие как ГАДНТ и АДНТ, не были выявлены.

  1. Трансформация ТНТ культивируемыми клетками гречихи татарской Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn

По результатам тестов на фитотоксичность ТНТ для изучения трансформирующей активности клеточных культур растений оптимальной можно считать концентрацию ксенобиотика 50 мг/л [Vank et al., 2003; Ramishvili et al., 2007].

Инкубация суспензии растительных клеток в фосфатном буфере с ТНТ приводила к закономерному снижению его концентрации. Для полной конверсии ТНТ в продукты его четырехэлектронного восстановления суспензией каллусных клеток требовалось 6 ч.

ВЭЖХ-анализ показал, что суспензионная культура F. tataricum трансформирует ТНТ по пути нитровосстановления. При этом в течение первого часа инкубации определялись изомерные ГАДНТ, далее происходила их конверсия в АДНТ, более масштабная, чем в случае бактериальных клеток (табл.).

Таблица 

Метаболиты, обнаруженные в процессе трансформации ТНТ суспензией клеток F. tataricum

Соединение

Времена удерживаний в условиях ВЭЖХ (300С), мин

Концентрация метаболитов через 3 ч инкубации, мкМ (нач. концентрация ТНТ 220 мкМ)

4-ГАДНТ

7.7

15.1

2-ГАДНТ

7.9

10.3

2-АДНТ

9.8

21.2

4-АДНТ

11.2

46.3

TНT

16.0

102.6

Согласно данным некоторых исследователей [Ramishvili et al., 2007], убыль ТНТ в инкубационной смеси, содержащей суспензию растительных клеток, может быть обусловлена не только его превращением до известных метаболитов, но и адсорбцией ксенобиотика на поверхности клеток каллуса. Кроме того, ряд авторов отмечает, что метаболиты ТНТ также способны к необратимому связыванию с компонентами клеточных стенок, в частности, с лигниноподобными структурами, что может проявляться в отсутствии баланса между концентрацией исходного ксенобиотика и обнаруживаемых методом ВЭЖХ метаболитов [Hughes et al., 1997; Vanderford et al., 1997; Hannink et al., 2002]. Результаты, полученные нами при анализе хроматограмм, позволяют считать, что адсорбции на поверхностных структурах клеток изучаемой нами культуры подвергается не более 10% ТНТ и не более 3-5% от общего количества метаболитов нитроредукции.

  1. Потребление кислорода суспензией бактериальных клеток

Для изучения роли кислорода в системе, содержащей ТНТ и клетки B. cereus ZS18, было проанализировано суммарное потребление кислорода в течение 2 ч. Установлено, что ТНТ усиливает потребление кислорода клеточной суспензией в 1.5-2 раза по сравнению с контролем (эндогенное дыхание в отсутствие глюкозы и ТНТ). Характерно, что превышение уровня потребления кислорода находилось в прямой зависимости от концентрации ТНТ (рис.3).

Рис. 3. Динамика потребления кислорода в системе покоящиеся клетки Bacillus cereus ZS18 (А600=2.0)+ТНТ в отсутствие экзогенного дыхательного субстрата. Потребление кислорода: 1 и 2 – при концентрации ТНТ 100 и 50 мг/л, соответственно; 3 – эндогенное дыхание в отсутствие ТНТ; 4 – то же, что 1, но при добавлении 1 мг/мл NaN3; 5 – то же, что 4, но при концентрации ТНТ 50 мг/л; 6 – то же, что 4, но в отсутствие ТНТ.

Для дифференциации собственно дыхательной активности клеток и нереспираторного потребления кислорода использовали дыхательный яд – азид натрия (NaN3). Уже в дозе 1 мг/мл NaN3 полностью блокировал как субстрат-индуцированное (глюкозное), так и эндогенное дыхание, не предотвращая при этом потребления кислорода в присутствии ТНТ (рис.3).

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 5 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»