WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 | 5 |

На правах рукописи

НАУМЕНКО Екатерина Анатольевна

УЧАСТИЕ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА В ПРОЦЕССЕ АЭРОБНОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ 2,4,6-ТРИНИТРОТОЛУОЛА

03.00.07 – микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Казань – 2008

Работа выполнена на кафедре микробиологии Казанского государственного университета им. В. И. Ульянова-Ленина

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор

Наумова Римма Павловна


Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

старший научный сотрудник

Коксин Владимир Петрович

(Лаборатория биохимии РЦПБ СПИД,

г. Казань)

доктор биологических наук, профессор Леонтьевский Алексей Аркадьевич

(Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, г. Пущино)

Ведущая организация:

Казанский институт биохимии и биофизики КНЦ РАН, г. Казань

Защита диссертации состоится «25» сентября 2008 г. в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 212.081.08 при Казанском государственном университете по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, д. 18, главное здание, ауд. 211.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Н. И. Лобачевского при Казанском государственном университете.

Автореферат разослан « » августа 2008 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук З. И.  Абрамова

Актуальность проблемы. Присутствие устойчивых химических токсикантов в окружающей среде вызывает всеобщую озабоченность в связи с воздействием этих загрязнителей на природные объекты и организм человека. Антропогенное влияние на окружающую среду приводит к ее загрязнению химически синтезированными соединениями – ксенобиотиками, которые содержат элементы химической структуры, редко или никогда не встречающиеся в природе. В связи с этим такие ксенобиотики не распознаются существующими ферментами биодеградации и, как следствие, они циркулируют и накапливаются в живых организмах и окружающей среде [Наумова, 1985; Peres, Agatos, 2000]. Нитроароматические соединения, одна из широко распространённых групп ксенобиотиков, используются в качестве взрывчатых веществ, гербицидов, инсектицидов, а также как сырье для производства полимеров, красителей, лекарств. Нитроарилы составляют группу важных экологически опасных загрязнителей в связи с их относительной стабильностью в биосфере, а также токсическими и мутагенными эффектами. Среди нитроароматических соединений наибольшее распространение получил 2,4,6-тринитротолуол (ТНТ), который несколько десятилетий использовался в качестве основного компонента взрывчатых смесей. Широкое применение ТНТ в ходе двух мировых войн привело к загрязнению наземных и водных экосистем.

Токсичность ТНТ и его метаболитов показана в различных тест-системах, от клеток бактерий до млекопитающих [Lachance et al., 2004]. Нитроарилы, в том числе ТНТ, выступают как причина апластической анемии, нарушений функций печени, развития катаракты. Кроме того, показана мутагенная активность ТНТ и его метаболитов по отношению к микроорганизмам и культурам клеток млекопитающих.

Абсолютное большинство микроорганизмов способно тем или иным образом воздействовать на молекулу ТНТ. Наиболее распространённым путём микробной трансформации данного соединения в аэробных условиях является последовательный двухэлектронный восстановительный механизм, приводящий к превращению нитрогруппы через нитрозо- и гидроксиламино- в аминогруппу. Наиболее полная восстановительная трансформация ТНТ до триаминотолуола выявлена только у строго анаэробных микроорганизмов [Preuss et al., 1992; Funk et al., 1993]. Возможно почти стехиометрическое восстановление ТНТ в ГАДНТ представителями родов Lactobacillus [Наумов с соавт., 1999] и Pseudomonas [Зарипов с соавт., 2004].

Несмотря на интерес исследователей к проблеме трансформации ТНТ, ряд принципиальных аспектов взаимодействия ксенобиотика с клетками остается неизученным. В частности, обращает на себя внимание тот факт, что вся мировая и отечественная литература, посвященная ТНТ, рассматривает либо восстановление его нитрогрупп, либо гидридное восстановление ароматического кольца. В то же время практически отсутствуют сведения о вовлечении кислорода в данный процесс и связанное с ним образование активных форм кислорода (АФК) в системе ТНТ-бактериальные клетки.

Цель данной работы – охарактеризовать участие активных форм кислорода в процессе трансформации 2,4,6-тринитротолуола клетками различного уровня организации.

Основные задачи исследования:

  1. Выделить из различных источников обитания и идентифицировать микроорганизмы, трансформирующие 2,4,6-тринитротолуол по пути восстановления его нитрогрупп с преимущественным образованием гидроксиламинодинитротолуолов в качестве метаболитов
  2. Выявить особенности образования активных форм кислорода метаболически различными штаммами с применением метода электронного парамагнитного резонанса, а также спектрофотометрически
  3. Охарактеризовать кинетические параметры трансформации 2,4,6-тринитротолуола, сопряженной с генерацией супероксидного анион-радикала
  4. Охарактеризовать особенности трансформации 2,4,6-тринитротолуола культивируемыми растительными клетками
  5. Выявить изменение физиологического состояния клеток различного уровня организации при взаимодействии с 2,4,6-тринитротолуолом

Научная новизна. Впервые методом ЭПР-спектроскопии, а также с применением спектрофотометрического анализа, выявлено, что контакт бактериальных клеток с ТНТ сопряжен с генерацией АФК, в частности, супероксид-аниона и гидроксильного радикала, во внеклеточном пространстве, тогда как взаимодействие клеток с другими полинитроарилами не приводит к образованию АФК. Проведено детальное изучение качественных и количественных характеристик образования кислородных радикалов на начальном этапе трансформации ТНТ у микроорганизмов из различных физиолого-таксономических групп. Показана генерация наиболее реактивной формы кислорода гидроксильного радикала при воздействии ТНТ на клеточную суспензию Lactobacillus plantarum, а также вторичное образование данного типа АФК на более поздних этапах трансформации ксенобиотика штаммом Bacillus cereus. Впервые выявлена роль ТНТ как индуктора окислительного стресса в культуре клеток растений. С применением оригинального подхода с привлечением хелаторов и комплексного соединения железа получены приоритетные данные, свидетельствующие о роли ионов металлов с переменной валентностью в инициации трансформации ТНТ по пути одноэлектронного восстановления. В работе впервые охарактеризована роль клеточной поверхности бактерий и ассоциированных с ней переходных металлов в процессе трансформации ТНТ. Впервые при использовании метода двойного флуоресцентного окрашивания показано изменение проницаемости клеток различного уровня организации в ответ на воздействие ТНТ.

Практическая значимость. Показанная в работе внеклеточная аккумуляция АФК на раннем этапе микробной трансформации ТНТ представляет интерес в связи с высокой токсичностью кислородных радикалов. Обнаруженное нами образование АФК клеточными суспензиями при контакте с ТНТ может вносить решающий вклад в проявление токсических и генотоксических эффектов ТНТ в отношении организмов разного эволюционного уровня. В целом, результаты данной работы позволяют по-новому взглянуть на механизмы развития профессиональных заболеваний при контакте с данным ксенобиотиком в условиях производства. Обнаружение закономерностей и предполагаемого механизма генерации АФК в процессе трансформации ТНТ бактериальными клетками позволяет пересмотреть концепцию начального этапа его микробного метаболизма. Установленная индукция окислительного стресса при взаимодействии растительных клеток с ТНТ in vitro имеет значение для определения оптимальных условий трансформации ксенобиотика in vivo при разработке стратегии фиторемедиации ТНТ-загрязненных территорий.

Связь работы с научными программами. Работа поддержана федеральными программами “Развитие научного потенциала высшей школы” РНП.2.1.1.1005, РНП.2.1.1.3222 и “Исследования и разработки по приоритетным направлениям науки и техники” ГК 02.434.11.3020, ГК 02.512.11.2050, ГК ФЦКП КГУ 02.451.11.7019, Комиссией Европейских Сообществ (грант ICA2-CT-2000-10006), индивидуальным грантом КГУ (2008 г.).

Положения, выносимые на защиту:

  1. С применение метода электронного парамагнитного резонанса, а также спектрофотометрического анализа выявлено, что начальный этап аэробной трансформации 2,4,6-тринитротолуола бактериями сопряжён с образованием активных форм кислорода
  2. У микроорганизмов из различных таксономических групп выявлены различия качественных и количественных характеристик генерации активных форм кислорода в ответ на контакт клеток с 2,4,6-тринитротолуолом
  3. Трансформация 2,4,6-тринитротолуола клетками различного уровня организации сопряжена с изменением клеточной поверхности как барьера проницаемости

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на школах-конференциях молодых ученых “Экотоксикология: современные биоаналитические системы, методы и технологии” (Пущино-Тула, 2006) и “Биология – наука XXI века” (Пущино, 2004, 2005, 2006, 2007), “Ломоносов-2007” (Москва,2007), научных конференциях “Биотехнология – охране окружающей среды” (Москва, 2004, 2005, 2006), “Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии” (Казань, 2004), “Проблемы региональной экологии в условиях устойчивого развития” (Киров, 2007), “Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии” (Екатеринбург-Пермь, 2007), “Биосистемы: организация, поведение, управление” (Нижний Новгород, 2007), международной конференции “Modern development of magnetic resonance” (Kazan, 2007), а также на итоговых конференциях КГУ (2005-2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 22 научные работы.

Благодарности. Выражаю глубокую признательность моему научному руководителю Наумовой Римме Павловне за разработку интересной научной темы и внимательное отношение к работе. Благодарю всех тех, кто помогал мне в работе над диссертацией: Гафарова Арслана Булатовича за помощь в идентификации микроорганизмов, Силкина Николая Ивановича и Родионова Александра за проведение ЭПР-спектроскопии, Шурхно Равилю Абдулловну за помощь в проведении ВЭЖХ, Гордона Льва Хаймовича и Валитову Юлию Наильевну за предоставление возможности постановки манометрических опытов и обсуждение полученных результатов, Сальникова Вадима Владимировича и Мухитова Александра Ринатовича за помощь в проведении флуоресцентной микроскопии, Румянцеву Наталью Ивановну за предоставление культуры растительных клеток, а также коллектив Лаборатории экологической биотехнологии и биомониторинга, в особенности Ложкина Андрея Петровича и Зиганшина Айрата Мансуровича, а также студентов – Субхангулову Айгуль Расыковну и Сырову Анну Викторовну. Отдельная благодарность инженерам кафедры микробиологии – Мочаловой Наиле Касимовне и Пономаревой Альфие Зарифовне.

Структура и объем диссертации Работа изложена на 128 страницах машинописного текста, содержит 4 таблицы и 37 рисунков. Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов исследований, обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы, включающего 195 источников, из них 169 на иностранном языке.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Бактериальные штаммы и культура растительной ткани. В работе использовали репрезентативные штаммы ТНТ-трансформирующих микроорганизмов Bacillus cereus ZS18, Pseudomonas putida EN1582, выделенные из отходов нефтехимического производства, а также Lactobacillus plantarum IL1. Трансформацию ТНТ и образование АФК изучали также на клетках неморфогенного каллуса гречихи татарской Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn линии 1-10, полученной из незрелого зародыша и состоящей из клеток паренхимного типа [Румянцева с соавт., 1992, 1998].

Определение видовой принадлежности бактериальных штаммов

Выделение геномной ДНК. Микроорганизмы выращивали на соответствующих твердых питательных средах (Bacillus sp. и Pseudomonas на среде МПА, Lactobacillus sp. на среде МРС (DeMan-Rogosa-Sharpe) [De Man et al., 1960]). Выделение ДНК проводили согласно стандартной процедуре miniPrep.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Для проведения ПЦР использовали смесь следующего состава: 200 мкM dNTP, 1.5 мM MgCl2, 200 пкM праймеров (forward primer 63f (CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC), reverse primer 1387r (GGG CGG WGT GTA CAA GGC), 1324 bp) [Marchesi, et al., 1998], 2.5 мкл буфера 10X, 0.5 ед ДНК-полимеразы. В кюветы для ПЦР вносили 24 мкл данного раствора и 1 мкл образца ДНК. Для проверки успешности процесса использовали стандартные маркеры.

Полимеразную цепную реакцию проводили в амплификаторе GeneAmp PCR System 2400 (PerkinElmer, США) по следующей программе: денатурация: 94оС 5 мин; денатурация:94оС, 2 мин; отжиг: 55оС, 30 сек; наращивание72оС, 2 мин (30 циклов); завершение: 72оС, 7 мин;

подготовка к хранению: 10оС.

Секвенирование продукта ПЦР. Секвенирование проводили на секвенаторе Beckman Coulter CEQ 2000XL по стандартной процедуре согласно протоколу Beckman. Установленные нуклеотидные последовательности 16S рДНК синтезированной на матрице 16S рРНК изучаемых штаммов сравнивали с последовательностями базы данных GenBank и RibosomalDataBaseProjectII.

Pages:     || 2 | 3 | 4 | 5 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»