WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 ||

На пятые сутки после введения препарата интенсивность окрашивания клеток гранулезы возросла. При этом выраженное bcl-2-позитивное окрашивание выявлялось не только в зернистом слое, но и затрагивало соединительно-тканный слой. Процент клеток иммуногистохимически позитивных к белку р53 имел незначительную степень выраженности признака и составлял менее 5%. Интенсивность коричневой окраски на Ki-67 была ярко выраженной и имела равномерность в распределении по зернистому слою.

На седьмые сутки с момента введения препарата общая интенсивность экспрессии bcl-2-протеинов уменьшилась. В это время отмечалась выраженная мозаичность иммуногистохимического окрашивания разных частей фолликула: участки окрашенных на bcl-2 клеток гранулезы чередовались с зонами, в которых было выражено сродство красителя к клеткам. Окраска на белок р53 показала, что процент клеток положительно реагирующих вновь увеличился. При этом концентрация р53 – позитивных клеток была сосредоточена по периферии зернистого слоя. Это связано, по-видимому, с повышением интенсивности апоптотических процессов вследствие снижения защитных свойств клетки, обусловленных понижением активности белка bcl-2. При исследовании срезов, окрашенных на маркер пролиферации Ki-67, наблюдалось неравномерное окрашивание клеток.

Анализ результатов полуколичественной оценки апоптотических процессов, протекающих в клетках гранулезы яичников свиней после введения гонадотропного препарата, позволяет сделать предположение, что усиление экспрессии bcl-2-белка на пятые сутки эксперимента связано со стимуляцией механизмов блокирующих апоптоз и осуществляющих антиоксидантную защиту клеток.

В это же время мы наблюдали уменьшение процента клеток положительно реагирующих при окраске на белок р53, что также указывает на снижение апоптотических процессов в клетках.

Сравнительное изучение выраженности апоптоза в клетках гранулезы до и после введения препарата позволило выявить значительные колебания количественных показателей индекса апоптоза, пролиферативного индекса и экспрессии белка bcl-2. Было установлено, что пролиферативный индекс, полученный с использованием иммуногистохимического определения ядерного антигена пролиферирующих клеток Ki-67, имел тенденцию к увеличению после ведения препарата, в отличие от контроля. Так, у животных контрольной группы он составлял 47,3±1,5%, а у свинок второй и третьей опытной группы, что соответствовало 3 и 5 суткам после введения гонадотропного препарата, пролиферативный индекс был выше и достигал соответственно 49,2±3,2% и 52,5±2,0%. Однако, у свинок, у которых исследовали материал на 7 сутки после введения препарата, пролиферативный индекс снижался (50,7±3,6%).

Экспрессия белка bcl-2 в период исследований изменялась параллельно динамике пролиферативного индекса. В клетках гранулезы фолликулов у свинок на 3 сутки после введения препарата экспрессия bcl-2 составляла 87,3±4,8%, на 5 сутки – 90,7±5,2%, что соответственно на 1,6 и 5,1% было больше по сравнению с контролем. В то же время на 7 сутки после введения гонадотропного препарата экспрессия белка bcl-2 вновь понизилась и составляла 87,7±4,9%.

Что касается индекса апоптоза, то его динамика была противоположной динамике пролиферативного индекса и экспрессии белка bcl-2. Так, у контрольных свинок индекс апоптоза в клетках гранулезы фолликулов составлял 3,1±0,3%. У свинок опытных групп на 3 и 5 сутки после введения гонадотропного препарата он понизился и соответственно достигал 2,5±0,2 и 2,0±0,2%. Однако, на 7 сутки после введения препарата он вновь увеличился (2,7±0,3%).

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что гонадотропины оказывают блокирующее действие на процесс апоптоза в клетках гранулезы фолликулов в яичниках свиней.

3.6. Иммуногистохимическая характеристика апоптоза клеток

гранулезы фолликулов в яичниках свиней после введения люлиберина

Исследование процесса апоптоза в клетках гранулезы фолликулов в яичниках свиней после введения препарата «Сурфагон» позволило выявить определенное сродство клеток к маркеру р53. При этом количество апоптоз-положительных клеток составляло в среднем 1,5%, и в основном они обнаруживались по периферии фолликула, а в яйценосном бугорке такие клетки не выявлялись. Результаты изучения маркера пролиферации Ki-67 в исследуемой группе подтвердили снижение пролиферативной активности клеток и неравномерность в их окраске.

У подопытных свинок через 24 час после введения препарата количество клеток зернистого слоя, имеющих ярко-коричневую равномерную окраску к маркеру bcl-2 уменьшилось, а количество клеток, имеющих сродство к р53, наоборот, имело тенденцию к увеличению. Однако такие клетки, как и в предыдущем случае, в основном выявлялись по периферии фолликула. Что касается маркера пролиферации Ki-67, то в ходе исследований наблюдалось снижение сродства к нему, которое характеризовалось слабо выраженной коричневой окраской клеток.

При этом в атретических фолликулах сродство к маркеру р53 было отчетливо выраженным и характеризовалось яркой окраской и отсутствием мозаичности, тогда как к маркеру bcl-2 сродство клеток практически не проявлялось.

Через 48 час после введения препарата в зернистом слое третичных и вторичных фолликулов наблюдали картину, схожую с таковой у контрольной группы животных. Полуколичественная оценка результатов показала лишь отличия при исследовании окраски к маркеру пролиферации, которая характеризовалась слабой выраженностью, лишь отдельные клетки имели ярко-коричневую окраску.

Количественная оценка пролиферативной активности имела тенденцию к снижению по сравнению с таковой в контрольной группе животных. Так, через 6 час после введения препарата пролиферативный индекс составлял 43,6±3,9%. Через 24 часа он повысился до 45,2±4,1%, что свидетельствует о снижении способности клеток к пролиферации. Однако у свинок, у которых исследовали фолликулы через 48 час после введения препарата, пролиферативный индекс имел тенденцию к увеличению (46,7±3,5%).

Анализ состояния экспрессии р53 показал, что через 6 час после введения препарата количество р53–положительно реагирующих клеток было не высоким и в среднем составляло 1,5±0,3%, тогда как в контроле данное значение достигало 2,6±0,6%. Через 24 часа процент апоптозных клеток увеличился до 3,9±0,7%, а через 48 час вновь отмечалась тенденция к снижению показателя (3,1±0,7%).

Проведенная оценка изменений экспрессии белка bcl-2 показала, что данный показатель через 6 час после введения препарата составлял 88,1±4,5%, через 24 час достигал 87,2±5,2%, а через 48 час – 86,9±5,3%. В контрольной группе животных показатель экспрессии белка bcl-2 составлял 85,6±5,4%. Расчет индекса апоптоза показал, что в контрольной группе свинок в клетках гранулезы фолликулов он составлял 3,3±0,3%. Через 6 часов, после введения люлиберина, индекс резко понизился и достигал 2,5±0,2 %. Однако, во второй опытной группе он вновь увеличился до 2,8±0,5%.

Таким образом, полученные нами данные указывают на то, что после введения сурфагона у свинок апоптотические процессы снижаются и активизируется процесс роста фолликулов. Об этом свидетельствует тот факт, что у свинок третьей группы масса яичников (6,3±0,21г), их объем (5,3±0,35см3), количество фолликулов, размеры которых превышали 0,5см (19,8±0,44), было больше, чем у свинок других групп. При этом по сравнению с контрольными животными (5,10±0,20г; 4,4±0,27 см3; 16,4±0,35) эти различия являлись статистически достоверными (р<0,05).

В свою очередь иммуноферментный анализ половых гормонов показал, что у свинок третьей группы содержание в крови эстрадиола-17 (84,6±4,2пмоль/л) было достоверно больше (р<0,05) по сравнению с контрольными животными (68,0±6,0 пмоль/л). Что касается прогестерона, то существенных различий (р>0,05) в его содержании в крови свинок опытных и контрольных групп нами выявлено не было.

Что касается прогестерона, то существенных различий (р>0,05) в его содержании в крови опытных и контрольных групп нами выявлено не было.

Таким образом, полученные нами данные указывают на то, что после введения сурфагона у свинок апоптотические процессы снижаются и активизируются процесс роста фолликулов. Об этом сивдетельствует тот факт, что у свинок третьей группы, масса яичников (6,3±0,21г), их объем (5,3±0,35см3), количество фолликулов размеры которых превышали 0,5см (19,8±0,44), было больше чем у свинок других групп. При этом по сравнению с контрольными животными (5,10±0,20г; 4,4±0,27 см3; 16,4±0,35) эти различия являлись статистически достоверными (р<0,05).

4. ВЫВОДЫ

  1. Процесс апоптоза клеток гранулезы фолликулов в яичниках неполовозрелых и половозрелых ремонтных свинок происходит непрерывно и имеет однотипный характер. При этом его интенсивность у первых была более высокой, чем у вторых, на это указывает индекс апоптоза: у неполовозрелых свинок он находился в пределах 1,85±0,3 – 2,10±0,44, а у половозрелых - 1,65±0,5 – 1,78±0,85.
  2. С увеличением возраста свиней интенсивность апоптоза в клетках гранулезы снижается. Наиболее высокий индекс апоптоза был у животных 5-7 – месячного возраста (1,75±0,24-1,85±0,19), а наиболее низкий у 12-24-месячных (1,60±0,11 – 1,70±0,34).
  3. Интенсивность апоптоза в клетках гранулезы свиней связана с функциональной активностью аденогипофиза и яичников. У свинок с относительно высоким содержанием в крови гонадотропных гормонов и эстрадиола-17 индекс апоптоза был меньше (1,60±0,7 – 1,65±0,5), чем у животных с низким содержанием гормонов (1,85±0,3 – 2,0±0,7).
  4. Апоптоз клеток гранулезы является характерным признаком атрезии фолликулов:

- в фолликулах, находящихся на первой стадии атрезии, апоптотических клеток мало и они обнаруживаются преимущественно по периферии гранулезы;

- на второй стадии атрезии процесс апоптоза более интенсивно протекает в клетках яйценосного бугорка, постепенно затрагивая другие клетки зернистого слоя;

- на третьей стадии атрезии большинство клеток яйценосного бугорка подвержены апоптозу и выявляются лишь единичные клетки, не имеющие признаков гибели;

- на четвертой стадии атрезии фолликулов все клетки гранулезы подвержены апоптозу с образованием апоптозных телец.

  1. Маркеры апоптоза в клетках гранулезы bcl-2 и р53 являются показателями дальнейшего развития фолликула. При увеличении экспрессии белка bcl-2 процессы апоптоза блокируются и фолликул достигает преовуляторного состояния, при увеличении экспрессии р53 дальнейшее развитие фолликула идет по атретическому пути.
  2. Экзогенные гонадотропины изменяют интенсивность процесса апоптоза в клетках гранулезы фолликулов в яичниках свиней:

- введение препарата «Фоллимаг» сопровождается относительно высоким уровнем экспрессии белка bcl-2 и снижением продукции гена р53, что ведет к уменьшению количества гибнущих клеток в гранулезе.

- пролиферативный индекс на 3 и 5 сутки после введения препарата «Фоллимаг соответственно составил 49,2±3,2% и 52,5±2,0%, что было больше, чем в контроле (47,3±1,5%), а индекс апоптоза, наоборот, в это время уменьшился соответственно до 2,5±0,2% и 2,0±0,2% по сравнению с контролем (3,1±0,3%).

7. Синтетический люлиберин изменяет интенсивность апоптотических процессов в клетках гранулезы фолликулов в яичниках свиней. Через 6 часов после введения препарата «Сурфагон» экспрессия белка bcl-2 повысилась на 2,5% и уменьшился индекс апоптоза на 1,0% по сравнению с контролем.

5. Практические предложения

  • Полученные интерьерные показатели у ремонтных свинок крупной белой породы как физиологические нормативы могут быть использованы при разработке новых способов и средств биологической стимуляции репродуктивной функции свиноматок, а также в клинической практике и в учебных целях при подготовке специалистов зооветеринарного профиля.
  • Выявленные свойства люлиберина и гонадотропных гормонов оказывать влияние на течение апоптоза в клетках гранулезы, можно использовать при изыскании эффективных путей регуляции программированной гибели клеток, контроля их роста и дифференцировки, с целью предотвращения возникновения различных патологических состояний.

6. Список опубликованных работ

  1. Сеин О.Б. Особенности апоптоза в клетках тканей яичников кроликов / О.Б. Сеин, М.А. Паюхина // Материалы ХІ международной научно-практической конференции «Проблемы сельскохозяйственного производства на современном этапе и пути их решения». – Белгород, 2007. – С.220.
  2. Паюхина М.А. Апоптозный индекс и экспрессия маркеров апоптоза в клетках гранулезы фолликулов свиней / М.А. Паюхина, О.Б. Сеин // Материалы международной научно-практической конференции «Проблемы и перспективы развития аграрного производства». – Смоленск, 2007. – С.391-392.
  3. Паюхина М.А. Изучение апоптоза гранулезы фолликулов яичников, находящихся на разных этапах развития у свиней / М.А. Паюхина // Материалы ІІ Всероссийской научно-практической конференции «Ветеринарная медицина – теория, практика и обучение». – Санкт-Петербург, 2007. – С.55-56.
  4. Паюхина М.А. Интенсивность апоптоза и показатель пролиферативной активности при исследовании клеток гранулезы фолликулов свиней / М.А. Паюхина, О.Б. Сеин // Материалы ХІ международной научно-практической конференции «Вклад молодых ученых в реализацию приоритетного национального проекта развития агропромышленного комплекса». – Троицк, 2007. – С.130-131.
  5. Сеин О.Б. Оценка апоптотических процессов в клетках гранулезы зрелых и атретических фолликулов свиней / О.Б. Сеин, М.А. Паюхина // Материалы международной научно-практической конференции «Трансферт инновационных технологий в животноводстве». – Орел, 2008. – С.177-179.
  6. Паюхина М.А. Апоптоз клеток гранулезы в зрелых фолликулах яичников свиней / М.А. Паюхина // Межвузовский сборник научных трудов Современный мир, природа и человек. Естествознание и гуманизм. – Томск, 2007. - Т.4. - №4. - С.38.
  7. Сеин О.Б. Морфологические особенности апоптоза клеток гранулезы в фолликулах свиней / О.Б. Сеин, М.А. Паюхина // Материалы международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы повышения эффективности агропромышленного комплекса». – Курск, 2008. – Т.3. – С.132-133.
  8. Сеин О.Б. Пути ингибирования апоптоза в клетках гранулезы фолликулов яичников у свиней / О.Б. Сеин, М.А. Паюхина // Материалы научно-практической конференции, посвященной 125-летию образования ветеринарной службы Курской области «Актуальные проблемы ветеринарной медицины». – Курск, 2008. – С.357-359.
  9. Сеин О.Б. Процесс атрезии фолликулов в яичниках свиней в период становления половой функции / О.Б. Сеин, Д.О. Сеин, М.А.
    Pages:     | 1 | 2 ||






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»