WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 |

На правах рукописи

Паюхина Марина Александровна

ОСОБЕННОСТИ АПОПТОЗА КЛЕТОК ГРАНУЛЕЗЫ

ФОЛЛИКУЛОВ В ЯИЧНИКАХ СВИНЕЙ И ЕГО ВЗАИМОСВЯЗЬ

С ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТЬЮ

ГИПОФИЗАРНО-ОВАРИАЛЬНОЙ СИСТЕМЫ

03.00.13 – физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Белгород – 2009

Работа выполнена на кафедре терапии и акушерства ФГОУ ВПО «Курская

государственная сельскохозяйственная академия имени профессора И.И. Иванова»

Научный руководитель: заслуженный ветеринарный врач РФ,

доктор биологических наук, профессор

Сеин Олег Борисович

Официальные оппоненты: заслуженный ветеринарный врач РФ,

доктор биологических наук, профессор

Безбородов Николай Васильевич

доктор биологических наук, профессор

Козлов Владимир Егорович

Ведущая организация Орловский государственный аграрный университет

Защита диссертации состоится _____ 2009 года в «____» часов на заседании диссертационного совета Д 220.004.01 при ФГОУ ВПО «Белгородская госу-дарственная сельскохозяйственная академия» по адресу: 308503, Белгородская область, пос. Майский, ул. Вавилова, д.1. Тел/факс 8(4722) 39-22-62

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО Бел ГСХА

Автореферат разослан «____» 2009 г.

Учёный секретарь

диссертационного совета,

доцент Ю.Н. Литвинов

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Значительный прогресс, достигнутый в понимании молекулярной биологии клетки, позволил по-иному оценить многие процессы, протекающие в ней. Более детально изучены механизмы контроля клеточного деления, поддержания генетической стабильности, путей передачи сигналов от рецепторов в ядро. Одним из таких механизмов, участвующих в поддержании гомеостаза на тканевом и системном уровнях, является апоптоз – особый вид гибели клеток, который наблюдается как в условиях нормальной, так и патологической жизнедеятельности животных.

Исследование молекулярных механизмов запрограммированной гибели клеток стало в настоящее время одной из самых актуальных проблем биологических наук, поскольку сбои в реализации программы апоптоза в клетках лежат в основе патогенеза и прогрессии ряда заболеваний. Нарушение генетически запрограммированных процессов клеточной гибели, а именно ингибиции апоптоза может привести к неуправляемой со стороны гормональной системы организма клеточной пролиферации и развитию новообразований, возникновению аутоиммунных заболеваний.

Апоптоз стал неотъемлемым инструментом для осуществления наследственного и приобретенного, гуморального и клеточного ответа иммунной системы. Изучение процесса апоптоза открывает новые перспективы в клеточной биологии и иммунологии.

В последние годы у исследователей повысился интерес к процессам апоптоза, протекающего в репродуктивных органах самок, в частности тканях матки и яичников. Ученых интересует роль апоптоза в развитии фолликулов и их атрезии, какова его интенсивность в течение полового цикла, и какое влияние оказывают на него гонадотропные и половые гормоны. Осуществляются попытки регуляции апоптоза в фолликулах яичников с использованием различных ингибиторов (С.В. Стрижикова, 2000; L. Zhong-Hua et al., 2002; L. Chang-Kyn, 2002). Однако имеющиеся в источниках литературы сведения не многочисленны, выполнены на разных видах животных и нередко носят противоречивый характер.

Цель и задачи исследований. Принимая во внимание актуальность и научно-практическую значимость указанной проблемы, целью настоящей работы являлось изучение особенностей процесса апоптоза клеток гранулезы фолликулов в яичниках свиней и его взаимосвязь с функциональной активностью гипофизарно-овариальной системы. Исходя из этого были поставлены следующие задачи:

1. Изучить морфологическое проявление апоптоза клеток гранулезы фолликулов и гормональную активность аденогипофиза и яичников у свиней до полового созревания.

2. Установить особенности апоптоза клеток гранулезы фолликулов и гормональной активности аденогипофиза и яичников у свиней в возрастном аспекте.

3. Выяснить роль апоптоза клеток гранулезы в процессе атрезии фолликулов в яичниках свиней.

4. Изучить влияние экзогенных гонадотропных препаратов на активность процесса апоптоза в клетках гранулезы в фолликулах яичников свиней.

5. Получить иммуногистохимическую характеристику апоптоза клеток гранулезы фолликулов в яичниках свиней после введения люлиберина.

Научная новизна. На основании результатов морфологических и иммуногистохимических исследований выяснено, что клетки гранулезы подвергаются апоптозу на разных стадиях развития фолликулов в яичниках свиней. Показано, что атрезия клеток гранулезы фолликулов тесным образом связана с функциональной активностью аденогипофиза и яичников и зависит от содержания в крови гонадотропных и половых гормонов. Впервые выявлены особенности апоптоза клеток гранулезы фолликулов в яичниках свиней, находящихся на разных стадиях атрезии. Получены новые данные о влиянии на апоптоз клеток гранулезы экзогенных гонадотропных препаратов и люлиберина.

Отличие результатов исследований от результатов, полученных другими авторами, заключается в том, что исследования были выполнены не на модулируемых системах и лабораторных животных, а на свиньях разного возраста и физиологического состояния. При этом использовались комплекс методов: гистологические, иммуногистохимические, гормональные. Это позволило изучить особенности апоптоза клеток гранулезы и гормонального статуса у неполовозрелых и половозрелых свинок, выяснить роль апоптоза в процессе атрезии фолликулов и изучить влияние экзогенных гонадотропинов и люлиберина на процесс апоптоза клеток гранулезы фолликулов в яичниках свиней.

Теоретическая и практическая значимость. Результаты исследований особенностей апоптоза клеток гранулезы фолликулов в яичниках свиней существенно дополняют представления о механизме атрезии фолликулов и интерьерных перестройках, происходящих в репродуктивной системе самок в возрастном аспекте.

Полученные данные можно использовать при разработке новых средств биологической стимуляции овуляции у свиноматок, а также в учебном процессе при изучении курсов физиологии и ветеринарного акушерства.

Реализация результатов исследований. Основные научные положения и предложения производству вошли в рекомендации «Физиологические особенности формирования половой функции у свиней» (Курск, 2007).

Основные положения, выносимые на защиту:

  • Результаты качественных и количественных показателей проявления апоптоза клеток гранулезы на разных стадиях развития фолликулов в яичниках свиней.
  • Особенности процесса апоптоза клеток гранулезы у свиней в возрастном аспекте и его взаимосвязь с функциональной активностью гипофизарно-овариальной системы.
  • Взаимосвязь процессов апоптоза клеток гранулезы и атрезии фолликулов в яичниках свиней.
  • Иммуногистохимическая характеристика процесса апоптоза клеток гранулезы в фолликулах свиней после введения экзогенных гонадотропинов и люлиберина.

Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на международных научно-практических конференциях «Региональные проблемы повышения эффективности агропромышленного комплекса» (Курск, 2006), «Вклад молодых ученых в реализацию приоритетного национального проекта развития агропромышленного комплекса» (Троицк, 2007), «Ветеринарная медицина – теория, практика и обучение» (Санкт-Петербург, 2007), «Проблемы сельскохозяйственного производства на современном этапе и пути их решения» (Белгород, 2007), «Проблемы и перспективы развития аграрного производства» (Смоленск, 2007), «Актуальные проблемы повышения эффективности агропромышленного комплекса» (Курск, 2007), «Трансферт инновационных технологий в животноводстве» (Орел, 2008), «Актуальные проблемы ветеринарной медицины» (Курск, 2008); всероссийском конкурсе на лучшую научную работу среди аспирантов и молодых ученых высших учебных заведений Министерства сельского хозяйства РФ в номинации «Ветеринарные науки» (Белгород, 2008), научных конференциях профессорско-преподавательского состава Курской ГСХА имени И.И. Иванова (Курск, 2005 – 2008);

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 134 страницах компьютерного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения, список использованной литературы. Список литературы включает 238 источников, в том числе 167 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 10 таблицами и 26 рисунками. По результатам исследований опубликовано 10 научных статей, в том числе 1 в издании, рекомендованном ВАК РФ.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена в период с 2005 по 2008 гг. на базе межкафедральной научно-исследовательской лаборатории факультета ветеринарной медицины и учебно-опытного хозяйства «Знаменское» Курской государственной сельскохозяйственной академии имени профессора И.И. Иванова; лаборатории Курского областного бюро патологической анатомии.

Объектом исследований являлись ремонтные свинки крупной белой породы. Животных подбирали по принципу аналогов с учетом происхождения, массы тела, возраста и развития. Материалом для исследований служили яичники, которые получали от свинок после убоя или овариоэктомии в условиях хозяйства или мясокомбината.

Экспериментальная часть работы состояла из трех серий опытов.

В первой серии опытов изучали особенности апоптоза в клетках гранулезы фолликулов в яичниках свиней в возрастном аспекте. С этой целью проводили отбор яичников у неполовозрелых и половозрелых свинок 5-месячного возраста, а также у 7-, 9-, 12- и 24-месячного возраста. У неполовозрелых свиней яичники получали во время стадии уравновешивания полового цикла.

У всех подопытных животных брали кровь, в которой определяли общие гематологические показатели (СОЭ, гематокрит, содержание эритроцитов, лейкоцитов, гемоглобина), содержание эстрадиола-17 и прогестерона.

Вторая серия опытов была посвящена изучению процессов апоптоза и атрезии фолликулов в яичниках свиней. Данные процессы исследовали у свинок 5-месячного возраста.

В третьей серии опытов изучали влияние экзогенных гонадотропинов и люлиберина на течение апоптоза в клетках гранулеза фолликулов в яичниках свиней.

В качестве гонадотропинов был выбран препарат «Фоллимаг». Опыты проводили на свинках 9-месячного возраста, из которых было сформировано 5 групп. В первую группу входили контрольные животные; во 2 группу входили свинки, у которых отбор яичников проводили на первые сутки после введения препарата; в 3 группу - на третьи сутки; в 4 группу – на пятые сутки; в 5 группу – на седьмые сутки после введения препарата. Препарат вводили внутримышечно в дозе 1000 ИЕ/гол.

В качестве люлиберина был выбран препарата «Сурфагон». Для выяснения его влияния на течение апоптоза в клетках гранулезы было сформировано четыре группы свинок 6-месячного возраста. Свинки 1, 2 и 3 группы являлись опытными, им вводили внутримышечно и однократно сурфагон в дозе 50 мкг/гол. Свинки 4 группы являлись контрольными, им вводили стерильный физиологический раствор. У свинок 1 опытной группы яичники отбирали через 6 часов после введения препарата, у свинок 2 и 3 группы – соответственно через 24 и 48 часов. У контрольных животных овариэктомию проводили через 24 часа после введения физиологического раствора.

В ходе выполнения диссертационной работы использовали комплекс методов.

Масса, линейные и объемные параметры. Массу устанавливали с использованием электронных весов. Диаметр яичников и фолликулов измеряли штангенциркулем. Объем определяли путем погружения в мерный сосуд с водой.

Гистологические исследования. Изготовление гистологических препаратов осуществляли по общепринятой схеме: фиксация материала, обезвоживание в спиртах возрастающей концентрации и ксилоле, заливка в парафин, приготовление парафиновых срезов на санном микротоме (Д.С. Саркисов, 1996). Окрашивали гистопрепараты гематоксилин-эозином. Для морфометрических измерений использовали винтовой окуляр-микрометр.

Иммуногистохимические исследования. Проводили стрептавидин–биотиновым иммунопероксидазным методом на парафиновых срезах ткани яичников с использованием моноклональных мышиных антител к PCNA – Anti-Proliferating Cell Nuclear Antigen, Clone bcl-2 (1:300, Dako); Clone Ki-67 (1:25, Dako); p53, DO-7 (1:25, Dako). Демаскировку антигена проводили в цитратном буфере (рН=6,0) в бытовой СВЧ-печи «SAMSUNG –M1774R». Для приготовления препаратов использовали стекла, покрытые силаном (DAKO S 2024).

Количественные исследования проводили путем определения индекса апоптоза (ИА) в 10 случайно выбранных полях зрения (100 клеток) как долю (в %) положительно окрашенных ядер клеток гранулезы фолликулов яичников с соответствующими морфологическими признаками.

Аналогичным образом, что и индекс апоптоза, определяли в клетках гранулезы фолликулов яичников индекс пролиферации (ядерная метка Ki-67) и экспрессию р53, bcl-2.

Для оценки морфологических изменений зернистого слоя фолликулов использовали специальную визуально-аналоговую шкалу для полуколичественного определения выраженности активности процесса апоптоза (Аруин Л.И., 1997).

Гормональные методы. Определение в плазме крови гонадотропных препаратов (ФСГ, ЛГ) проводили методом биологического тестирования (A.Parlow, 1961) после их предварительного концентрирования в плазме крови путем насыщения сернокислым аммонием (М.И. Прокофьев, Ю.А. Селиверстов, 1977). Содержание эстрадиола-17 и прогестерона в крови животных определяли иммуноферментным методом с использованием наборов «Vismarа».

Биометрические исследования. Полученные в ходе проведенных исследований данные подвергали биометрической обработке (П.Ф. Рокицкий, 1973) с использованием ПВЭМ «IBM PC/AT».

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Апоптоз клеток гранулезы и функциональная активность

гипофизарно-овариальной системы у свиней в период

полового созревания

Pages:     || 2 | 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»