WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методики исследования, изложения экспериментальных данных, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы, содержащего 359 источников. Работа, изложенная на 179 страницах машинописного текста, включает 49 рисунков и 3 таблицы.

Работа поддержана грантами: Российского фонда фундаментальных исследований (1996-1998, 1999-2001, 2002-2004 и 2006 гг.), Российской академии наук для научных проектов молодых ученых РАН по фундаментальным и прикладным исследованиям (2000-2002 гг.), Президиума РАН «Фундаментальные науки – медицине» (2002-2006 гг.), Санкт-Петербургского научного центра РАН (2005-2006 гг.), а также персональными грантами Физиологического общества Великобритании (1995-1998 гг.) и правительства С.-Петербурга для студентов, аспирантов и молодых ученых (1997 и 1998 гг.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 73 работы: 17 статей и 56 тезисов.

2. Материалы и методы

Работа проведена на 515 крысах линии Вистар с момента рождения до 30 суток и на 402 взрослых крысах-самцах (в возрасте 3-4 месяца) линии Вистар.

Для получения потомства, перенесшего пренатальное гипоксическое воздействие, беременных самок (на 13,5-е или 18,5-е сутки беременности) сажали на 3 часа в специальную камеру с пониженной концентрацией О2 до 7,0%. Животных контрольной группы содержали в камере при нормальной концентрации О2.

Было исследовано потомство контрольных самок и самок, перенесших гипоксию на 13,5-е (группа ГЕ13,5) или 18,5-е (группа ГЕ18,5) сутки беременности. В течение 1 месяца с момента рождения проводили ежедневную регистрацию веса тела животных, а также регистрацию основных этапов развития: время отделения наружного уха от кожи головы и открытия глаз. Для оценки двигательной активности молодых животных контрольной и экспериментальных групп использовали современные методики тестирования позно-тонических реакций (поворот со спины на живот, отрицательный геотропизм, реакция постановки конечности на опору, способность удерживаться на поворачивающейся сетке, горизонтальной проволоке и поворачивающемся стержне) и локомоции.

Для тестирования кратковременной памяти взрослых животных использовали радиальный 8-лучевой лабиринт. Крысу сажали на середину центральной платформы, к стенке которой крепились пронумерованные лучи, и позволяли выполнить 8 посещений кормушек, располагавшихся в конце каждого луча. Повторное посещение луча считали ошибочным и для оценки способности к ориентации вычисляли процент правильных посещений. После каждого животного центральную платформу протирали 50% раствором этилового спирта

При обучении молодых (3-4-недельных) и взрослых (3-4-месячных) животных инструментальным пищедобывающим движениям были использованы две схемы обучения:

1. Часть животных обучали только нажимать передней лапой на поршень без длительного давления. У этих крыс подкреплялись все 64 движения при заданном времени давления, равном нулю (Т=0).

2. Часть животных обучали замедлять движения и давить на поршень более заданного времени, равного 50мс (Т>50мс). Критерием уровня обучения крысы в этой группе являлось статистически достоверное изменение среднего времени давления в течение более чем семи циклов тренировки.

Обученным инструментальному рефлексу животным билатерально вводили карбахол (Sigma, USA) в дозах 0,03 мкг (2x10-10 M), 0,3 мкг (2x10-9 M), 3 мкг (2x10-8 M) или скополамин (Sigma, USA) в дозах 0,3 мкг (8,8x10-10 M), 3 мкг (8,8x10-9 M) в 1 мкл физиологического раствора в сенсомоторную кору (AP=-1,5; L=2,5-3,5; H=0 мм), дорзальный (AP=-1,5; L=3,5; H=3,5 мм) или вентральный стриатум (AP=-2,0; L=1,5; H=6,0 мм) по атласу и терминологии Fifkova, Marsalla (1967). Каждую вторую из последующих инъекций проводили на 0,5 мм глубже предыдущей. Одно животное получало не более 8 инъекций. Процедура введения веществ в мозг животных занимала около 3 минут, после чего через 60, 120, 180 минут, а также в последующие сутки, проводилось по одному циклу тестирования. Контроль места введения осуществлялся по трекам на срезах мозга после окончания опытов.

В другой серии экспериментов исследовали воздействие i.c. (AP=-1,5; L=2,5-3,5; H=0 мм) инъекций 5,2x10-3 мкг (10-5 М) или 5,2x10-2 мкг (10-4 М) батимастата (SmithKline Beecham Pharmaceuticals, Harlow, UK), а также 0,59 мкг (10-3 М) или 5,9 мкг (10-2 М) фосфорамидона (Sigma, USA) в 1 мкл физиологического раствора на поведение взрослых крыс в радиальном лабиринте. В контрольных опытах животным вводили такой же объем физиологического раствора. Часть работы была проведена на крысятах-самцах линии Вистар, которым под рауш-наркозом двукратно (на 5-е и 7-е сутки после рождения) были произведены билатеральные инъекции батимастата (2,6x10-2 мкг (10-4 М) в 0,5 мкл физиологического раствора), фосфорамидона (2,9 мкг (10-2 М) в 0,5 мкл физиологического раствора) или физиологического раствора непосредственно через незатвердевшую кость черепа в теменную область коры мозга. По истечении 6 месяцев после этой процедуры животных тестировали в радиальном 8-лучевом лабиринте.

Обработку полученных результатов проводили с использованием программы Microsoft Exel 7.0 для Windows 98 и программы SigmaStat 3.0. Данные анализировали с помощью описательной статистики, которая оценивала среднее арифметическое значение и ошибку среднего арифметического. Проверку гипотезы о равенстве средних в случаях с нормальным распределением осуществляли при помощи критерия Стьюдента. В других случаях использовали непараметрический критерий Манна-Уитни-Вилкоксона. Оценку качественных признаков проводили по критерию Фишера. Различия считали статистически достоверными при 5% уровне значимости.

3. Результаты исследования и их обсуждение

3.1. Влияние пренатальной гипоксии на развитие двигательного поведения в онтогенезе крыс.

3.1.1. Физиологическое развитие животных, перенесших пренатальную гипоксию.

Пренатальная гипоксия на Е13,5 приводит к снижению веса тела, отставанию физиологического развития животных (время отделения наружного уха и открытия глаз) на 1-2 дня и нарушению процесса развития нормальных двигательных реакций во всех использованных тестах в первый месяц постнатального онтогенеза (см. таблица). В группе ГЕ18,5, в отличие от группы ГЕ13,5, не наблюдалось статистически достоверного отставания от контроля по времени отделения наружного уха и времени открытия глаз (см. таблица). Однако на протяжении всего первого месяца тестирования вес тела крысят из группы ГЕ18,5 был существенно ниже по сравнению с контролем.

Таблица. Характеристики физиологического развития у крыс контрольной и экспериментальных групп.

Группы

Вес тела

новорожденных, г

Прибавление

веса за сутки, г

Время, сут

отделения ушей

открытия глаз

Контрольная

5,34±0,07

2,50±0,50

2,29±0,18

15,64±0,41

ГЕ13,5

4,79±0,08**

1,50±0,20

3,14±0,40*

17,32±0,20**

ГЕ18,5

5,00±0,16*

2,05±0,52

2,90±0,24

16,04±0,35

* - достоверные отличия от контроля при p<0,05; ** - p<0,01.

Обнаруженное в нашей работе снижение веса животных, перенесших пренатальную гипоксию, вполне согласуется с известными фактами ограничения внутриутробного роста и нарушения нормального развития эмбрионов в результате кислородной недостаточности (Nyakаs et al., 1996; Wiktor et al., 2004). В связи с тем, что рост плодов изначально регулируется инсулином и инсулиноподобным фактором роста-1 (Ashton et al., 1985), можно предположить, что изменения в активности одного или обоих этих факторов способствуют развитию ростовой недостаточности эмбрионов и новорожденных, перенесших пренатальную гипоксию в наших экспериментах. Это предположение подтверждается данными об изменении уровня содержания инсулиноподобного фактора роста-1 и связанных с ним протеинов в крови пуповины перенесших перинатальную асфиксию детей или пренатальную гипоксию крыс, что коррелирует со снижением веса новорожденных (Huang et al., 2004; Dinleyici et al., 2006).

3.1.2. Двигательные и позно-тонические реакции в первый месяц постнатального развития крыс, перенесших пренатальную гипоксию.

Сопоставление развития некоторых позно-тонических реакций и локомоции у контрольных и экспериментальных животных представлено на рис. 1. Однако наблюдаемые в группе ГЕ13,5 задержки развития двигательного поведения не являются полностью необратимыми и могут со временем компенсироваться. В течение 1-го месяца компенсируются реакция отрицательного геотропизма, ротация тела со спины на живот, способность удерживаться на вращающемся бревне, а к 4-м месяцам – вес тела, способность удерживаться на горизонтальной проволоке и локомоция.

По ряду тестов животные из группы ГЕ18,5 не отличались от контроля: поворот со спины на живот, отрицательный геотропизм, постановка конечности на опору, локомоция (рис. 2). Выявленные отличия в тестах, выполнение которых требует помимо координации движений развития определенного усилия мышц (способность удерживаться на горизонтальной проволоке, вращающейся сетке и на вращающемся деревянном стержне )(рис. 2), были менее

Рис. 1. Развитие двигательного поведения в первый месяц постнатального развития животных контрольной (черные точки) и ГЕ13,5 (белые точки) групп.

Для каждого возраста (0, 1, 2, 3 и т.д. суток) представлены усредненные значения выполнения рефлекса ± ошибка среднего. * - достоверные различия при p<0,05; ** - p<0,01; # - p<0,001.

Рис. 2. Развитие двигательного поведения в первый месяц поснатального развития животных контрольной (черные точки) и ГЕ18,5 (белые точки) групп.

Для каждого возраста (0, 1, 2, 3 и т.д. суток) представлены усредненные значения выполнения рефлекса ± ошибка среднего. * - достоверные различия при p<0,05; ** - p<0,01; # - p<0,001.

значительными по сравнению с группой ГЕ13,5. К 4-м месяцам в группе ГЕ18,5 исчезали различия с контролем по весу тела и способности удерживаться на горизонтальной проволоке.

Таким образом, пренатальное гипоксическое воздействие приводит к отставанию физиологического развития и становления двигательного поведения в раннем постнатальном онтогенезе. Наиболее значительные изменения в течение первого месяца постнатального развития возникают в результате гипоксического воздействия на Е13,5, когда в мозге преобладают процессы пролиферации и миграции клеток, но не на Е18,5, когда начинается активный процесс дифференцировки нервных клеток. У животных, перенесших пренатальную гипоксию, в процессе взросления нивелируется и полностью исчезает (к 4-месячному возрасту) изначально наблюдавшееся отставание в развитии врожденных двигательных реакции.

Для более полной характеристики поведенческого репертуара, помимо врожденных, исследовали приобретенные формы поведения, такие как пищедобывающие движения, требующие только нажатия (молодые крысы) или длительного давления (взрослые крысы) на поршень одной из передних конечностей, а также способность сохранять инструментальные движения после длительного перерыва, характеризующую долговременную память животных, и способность ориентироваться в радиальном 8-лучевом лабиринте, характеризующую кратковременную память животных.

3.1.3. Выученное пищедобывающие движения у молодых (3-4-недельных) и взрослых (3-4-месячных) крыс, перенесших пренатальную гипоксию на разных сроках эмбриогенеза.

Несмотря на то, что животные из группы ГЕ18,5, в отличие от животных группы ГЕ13,5, демонстрировали большую способность обучаться новым движениям, по окончании обучения они, подобно животным из группы ГЕ13,5, не достигали такого же уровня выполнения приобретенного навыка, как контрольные животные. Среднее время давления на поршень у взрослых животных в результате первичного обучения увеличивалось на 26,49±6,90% в группе ГЕ13,5 и 30,90±4,47% в группе ГЕ18,5, что статистически было меньше (р<0,05) изменений, достигнутых в ходе обучения контрольной группы (50,32±6,46%).

Для тестирования долговременной памяти исследовали сохранность выработанного инструментального рефлекса через длительный промежуток времени (5-недельный перерыв). Животные контрольной группы после перерыва сохраняли навык выполнения инструментальных движений с длительным давлением на поршень, т.е. у них среднее время давления до и после перерыва не отличалось и значительно (р<0,001) превышало среднее время давления, регистрируемое перед началом обучения. У животных, перенесших пренатальную гипоксию, после перерыва наблюдалось снижение среднего времени давления, достигавшее начального уровня, который регистрировался перед началом обучения (рис. 3).

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»