WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 |

На правах рукописи

УДК 575.22:597.583.1

Тимошкина Наталья Николаевна

внутривидовой ГЕНЕТИЧЕСКий полиморфизм

русского осетра (Acipenser gueldenstaedtii)

Специальность 03.00.15 – Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва -2009

Работа выполнена в Азовском научно-исследовательском институте рыбного хозяйства (АзНИИРХ).

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор

Усатов Александр Вячеславович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, Васецкий Сергей Григорьевич

доктор биологических наук,

профессор

Асланян Марлен Мкртычевич

Ведущая организация: Кубанский государственный университет

Защита состоится “25” марта 2009 г. в 14 часов на заседании Диссертационного совета № Д002.238.01 Учреждения Российской академии наук Института биологии развития РАН им. Н.К. Кольцова.

Адрес: 119334, г. Москва, ул. Вавилова, д. 26. Телефон: 8 (499) 135 33 22, факс: (499) 135-80-12, e-mail: idbras@bk.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения РАН Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Автореферат разослан 20 февраля 2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

кандидат биологических наук________________________Абрамова Е.Б.

e-mail: ele0806@yndex.ru

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Русский осетр (Acipenser gueldenstaedtii Brandt, 1833) относится к реликтовой группе хрящевых ганоидов, первые находки которых датируются верхнеюрским периодом (более 200 млн. лет). До недавнего времени вид был многочисленным в фауне внутренних водоемов Евразии (бассейнов Каспийского и Черного морей) и имел большое промысловое значение. На сегодняшний день, русский осетр, как и другие 24 представителя отряда Acipenseriformes, отнесен к группе редких видов и включен в Приложение II CITES (Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora) (Raymakers, 2006). Катастрофическое снижение численности русского осетра в основном обусловлено интенсивным строительством гидротехнических сооружений, препятствующих проходу половозрелых особей к местам нереста, расположенным в верховьях рек. Кроме того, высокий спрос и цена на черную икру и товарную осетрину привели к чрезмерному вылову (Vaisman, Raymakers, 2001). Восполнение численности русского осетра в значительной мере осуществляется за счет искусственного воспроизводства на рыбоводных заводах. Так, например, в азовской популяции доля искусственно воспроизведенных рыб достигает 95% (Реков и др., 2000). В связи с этим мероприятия по поддержанию численности вида должны учитывать сохранение его устойчивости, в значительной мере обусловливаемой его генетической гетерогенностью, и, соответственно, требуют знаний об эволюционно сформировавшейся популяционной структуре вида. Внутривидовая систематика русского осетра остается до сих пор предметом дискуссий. Основываясь на поведенческих, экологических и меристических признаках, одни авторы подразделяют A. gueldenstaedtii на 3–4 географически изолированные формы с несколькими нерестовыми популяциями в каждой (Берг, 1948; Чугунов и др., 1964; Подушка, 2003), другие выделяют только популяции (Соколов, 2002; Vecsei, 2004). В современной систематике наряду с морфологическим анализом широко используются методы оценки генетического полиморфизма с помощью молекулярных маркеров. Ранее проведенные исследования русского осетра выявили высокий уровень полиморфизма белков крови (Субботкин, 1987) и митохондриальной ДНК (Birstein, 2000; Корниенко и др. 2003; Doukakis et al., 2005; Rastorguev et al., 2008). Высокая плоидность генома (Birstein et al., 1997; Fontana et al., 2001), затрудняют анализ полиморфизма по ядерным маркерам. В литературе имеются данные по оценке полиморфизма некоторых видов осетровых рыб с помощью AFLP и микросателлитного (STR) анализа (Jenneckens et al., 2001; King et al., 2001; Congiu et al., 2002; Zane et al., 2002; Welsh et al., 2003). Популяционная структура и полиморфизм русского осетра по этим параметрам изучены в меньшей степени.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является исследование внутри- и межпопуляционного генетического полиморфизма русского осетра с помощью морфологического, а также молекулярно-генетического анализов с использованием методов RAPD, STR и ПЦР-идентификации митохондриальных гаплотипов.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи.

1. Исследовать уровень морфологической изменчивости азовской популяции русского осетра и сравнить с ранее опубликованными данными по изменчивости популяций Каспийского моря и северо-западной части Черного моря.

2. Изучить с помощью RAPD- и STR-маркеров внутри- и межпопуляционную генетическую изменчивость вида.

3. Определить тип наследования ряда известных микросателлитных (STR) маркеров в экспериментальных скрещиваниях русского осетра.

4. Оценить эффективность использования микросателлитных маркеров для определения популяционной принадлежности особей русского осетра.

5. С целью определения частоты встречаемости “baerii-like” митотипа провести широкомасштабный скрининг трех (каспийской, азовской и черноморской) популяций русского осетра.

Научная новизна полученных результатов. Впервые с помощью морфологических и молекулярно-генетических маркеров проведен сравнительный анализ изменчивости трех популяций русского осетра (азовской, каспийской и западно-черноморской). Исследована частота встречаемости митохондриального маркера («baerii-like» гаплотип) в азовской и черноморской популяциях. Для этих популяций определена также временная динамика частот встречаемости изученных митохондриальных гаплотипов. Предложена экспериментально обоснованная методика популяционной идентификации особей русского осетра с использованием базы аллельных частот STR-локусов. Получены молекулярно-генетические доказательства микроэволюционных процессов дивергенции черноморской и каспийской популяции с последующим отделением азовской популяции.

Практическая значимость работы. Полученные результаты имеют важное значение для изучения эволюционной систематики и филогении рода Acipenser и вида Acipenser gueldenstadtii. Предложен набор генетических маркеров, который используется для индивидуальной паспортизации половозрелых особей русского осетра на осетровых рыбоводных заводах Каспийского бассейна. Выявленная временная динамика частот «сибиреподобного» («baerii-like») гаплотипа мтДНК и популяционных частот STR-аллелей может быть использована для более корректной оценке промыслового возврата особей русского осетра при искусственном воспроизводстве осетровых в азовском бассейне.

В ходе выполнения экспериментальной части работы для постановки индивидуальных скрещиваний был создан лабораторный стенд для инкубации икры рыб, который зарегистрирован 27.05.2007 в Госреестре полезных моделей РФ (патент № 63172). Был предложен способ иммобилизации образцов очищенной ДНК, предусматривающий ее выделение, очистку и заключение в защитную оболочку для длительного хранения, что позволяет оптимизировать работу с тканевыми и ДНК-содержащими пробами (дата приоритета 14.11.2007).

Материалы диссертации включены в состав учебных материалов для занятий студентов биолого-почвенного факультета ЮФУ по курсам «Генетика» и «Теория эволюции», а также по специальным курсам кафедры генетики.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на Международной конференции «Новые технологии в защите биоразнообразия в водных экосистемах» (Москва, 2002); Международной научной конференции «Проблемы естественного и искусственного воспроизводства рыб в морских и пресноводных водоемах» (Ростов-на-Дону, 2004); Международном семинаре «Современные технологии мониторинга и освоение природных ресурсов южных морей России» (Ростов-на-Дону, 2005); I Международной конференции «Повышение эффективности использования водных биологических ресурсов» (Москва, 2006); II Международной рабочей встречи «Identification of Acipenseriformes Species in Trade» (Берлин, 2006); Международной научной конференции «Проблемы устойчивого функционирования водных и наземных экосистем» (Ростов-на-Дону, 2006); III Научно-практической конференции «Экологические проблемы. Взгляд в будущее» (СОЛ «Лиманчик», 2006); Съезде Украинского общества генетиков и селекционеров, посвященном 120-летию со дня рождения академика Н.И. Вавилова (Алушта, 2007); IX Съезде Белорусского общества генетиков и селекционеров (Гомель, 2007); Конференции «Вавиловские чтения – 2007» (Саратов, 2007); Международном симпозиуме «Структура и функционирование естественных и антропогенных экосистем» (Кишинев, 2008); II Международной научно-практической конференции «Повышение эффективности использования водных биологических ресурсов» (Москва, 2008); IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008); Международной конференции «Генетика, селекция, гибридизации, племенное дело и воспроизводство рыб» (Санкт-Петербург, 2008); II Международной научной конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 2008).

Публикация материалов исследования. По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ, из них 6 в журналах перечня ВАК, 10 тезисов докладов на международных конференциях, получено 2 патента.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы. Работа изложена на 118 страницах, содержит 31 рисунок и 25 таблиц. Список цитируемой литературы включает 153 источника.

Благодарности. Автор выражает глубокую признательность своему руководителю А.В. Усатову за внимательное и конструктивное руководство, Н.С. Мюге за неоценимую помощь в работе, при обсуждении диссертации. Также автор выражает благодарность группе исследователей, оказавших содействие в сборе материалов для настоящей работы: сотрудникам АзНИИРХ Ю.И. Рекову, Д.А. Подойницину, Н.А. Небесихиной, А.Е. Барминцевой (ВНИРО, г. Москва), А.Н. Михайлюку и А.К Чащину (ЮгНИРО, г. Керчь, Украина), В.Ю. Шевченко и И.М. Чурай (ДОРЗ, г. Херсон, Украина).

Материалы и методы исследования

Объектом настоящего исследования был русский осетр Acipenser gueldenstaedtii Brandt, 1833. Использовали особей из трех популяций (азовской, каспийской, черноморской), выловленных в 1999-2005 гг. в северо-западной акватории Черного моря (86 экз.), в Азовском море (92 экз.), а также в северной части Каспийского моря (360 экз.). Для молекулярно-генетических исследований прижизненно отбирали и фиксировали в 96%-ом этаноле тканевые пробы плавников рыб. Использовали также спилы первого луча грудного плавника особей из коллекции ихтиологических сборов АзНИИРХ, проводившихся в Азовском и Черном морях в период с 1960 по 1971 гг.

Для определения характера наследования STR-маркеров были поставлены экспериментальные скрещивания между произвольно отобранными родительскими парами русского осетра азовской популяции. Полученное потомство инкубировали до стадии перехода личинок на активное питание строго по семьям с использованием оригинального лабораторного стенда. Работы проводили на базе ФГУ «Ачуевский ОРЗ» (Краснодарский край) в 2006 г.

Морфометрический анализ проводили по признакам, общепринятым в систематике осетровых рыб: определяли число лучей в спинном плавнике (D), число лучей в анальном плавнике (A), число жаберных тычинок (GR), количество спинных жучек (DS), количество боковых жучек (LS), количество брюшных жучек (VS), длину головы (C), абсолютную длину тела (AL) (Vecsei и др., 2004). В сравнительный межпопуляционный анализ включены результаты аналогичных измерений рыб каспийской и черноморской популяций из работ Берга (1948) и Подушки (2003).

Тотальную ДНК выделяли из фрагментов плавников методом солевой экстракции (Aljanabi, Martinez, 1999), с нашими модификациями для экстракции ДНК из архивных спилов лучей плавника.

RAPD-анализ. В предварительных экспериментах из 30 случайных олигонуклеотидов, различающихся по размеру и содержанию GC-пар, мы отобрали пять праймеров, при использовании которых были получены четкие, стабильно воспроизводимые, полиморфные спектры (рис. 1): ОРА-05 (5’-AGGGGTCTTG-3’), ОРА-07 (5’-GAAACGGGTG-3’), OPВ3 (5’-CATCCCCCTG-3’), OPВ11 (5’-GTAGACCCGT-3’), Р8 (5’-CCTGACCAGGCACTGGCAGA-3’). ПЦР проводили в стандартных условиях (Зеленина и др., 2006). Продукты амплификации фракционировали методом электрофореза в 6%-ом ПААГ. Полученные RAPD-профили представляли в виде общей бинарной матрицы типа «объект-признак» с помощью программы Phoretix 1D Database (“Nonlinear Dynamics”, Великобритания).

Анализ микросателлитной ДНК (STR). Анализ проводили методом, первоначально разработанным для видов A. naccarii (Zane et al., 2006), A. fulvescens (Welsh et al., 2003) и A. oxyrinchus (King et al., 2001) по четырем микросателлитным локусам: An20, Afug41, Afug51, AoxD165. Условия проведения ПЦР были оптимизированы для исследуемого вида A.gueldenstadtii. ПЦР-продукты фракционировали в денатурирующем ПААГ согласно (Muyzer and Smalla, 2003).

Статистическая обработка данных. Учитывая доминантную природу RAPD-локусов и тетраплоидность исследованного вида, рассчитывали частоту рецессивного нуль-аллеля, несмещенную оценку гетерозиготности и ее дисперсию Var() согласно Хедрик (2003), Токарская и др. (2000). Эффективную численность популяции определяли вычислением с использованием экспериментально определенных параметров по предложенным нами формулам.

Pages:     || 2 | 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»