WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

Нами показано, что релаксирующее действие активаторов белков Epac и протеинкиназы А является дозозависимым. Полумаксимальные эффекты на сократимость аорты наблюдаются при концентрациях Sp-8-Br-cAMPS (активатор ПКА) и 8-pMeOPT-2'-O-Me-cAMP (активатор Epac) 17,0+0,6 и 64+7 мкМ, соответственно (рис.4). Из приведенных на рисунке 4 данных видно, что даже при насыщающих концентрациях активатора Epac 8-pMeOPT-2'-O-Me-сAMP расслабление было неполным, тогда как активация протеинкиназы А вызывает 100%-ое расслабление аорты.

Рис.4. Зависимость степени расслабления предсокращенной норадреналином аорты от концентрации Sp-8-Br-cAMPS (активатор протеинкиназы А) и 8-pMeOPT-2'-O-Me-cAMP (активатор Epac).

Принципиально важно было выяснить, действительно ли действие активаторов Epac (8-pMeOPT-2'-O-Me-cAMP и 8-CPT-2'-O-Me-cAMP) специфично и не опосредовано активацией протеинкиназы А. Специфичность действия активаторов белков Epac доказывают опыты, проведенные на тромбоцитах. Известно, что в тромбоцитах повышение уровня цАМФ блокирует увеличение концентрации цитоплазматического Са2+ и подавляет их агрегацию (Авдонин и соавт., 1985). Установлено, что цАМФ-зависимое подавление агрегации тромбоцитов происходит при участии протеинкиназы А. Действительно, как видно из приведенных в таблице данных, активация эндогенной протеинкиназы A Sp-8-Br-cAMPS полностью блокировала АДФ – индуцированную агрегацию тромбоцитов человека (таблица). В отличие от этого, активатор белков Epac 8-pMeOPT-2'-O-Me-cAMP в концентрации 200 мкМ не влиял на данный процесс. Аналогичные результаты были получены и в опытах на тромбоцитах крысы. Следовательно, белки Epac не ингибируют АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов. Второй вывод, который следует из этих результатов – это то, что активатор белков Epac 8-pMeOPT-2'-O-Me-cAMP даже в концентрации 200 мкМ не вызывает активацию протеинкиназы A, то есть является специфичным по отношению к белкам Epac.

Из этого следует, что расслабляющее действие активатора белков Epac на сосуды также не связано с активацией протеинкиназы А, поскольку использованная в этом случае концентрация 8-pMeOPT-2'-O-Me-cAMP была как минимум в два раза ниже, чем в экспериментах с тромбоцитами.

Таблица

Влияние активаторов белков Epac (8-p-MeOPT-2'-O-cAMP) и протеинкиназы А (Sp-8-Br-cAMPS) на агрегацию тромбоцитов человека, индуцированную АДФ

Условия экспериментов

Степень агрегации

5 мкМ АДФ

100 + 14 %

200 мкМ Sp-8-Br-cAMPS,

5 мкМ АДФ

-3,3 + 0,5 %

200 мкМ 8-p-MeOPT-2'-O-cAMP,

5 мкМ АДФ

99 + 4 %

Для каждого значения приведены данные 3-х измерений и стандартные ошибки среднего.

Дополнительным подтверждением вышесказанного являются опыты с ингибитором протеинкиназы A Rp-8-Br-cAMPS, добавление которого в концентрации 100 мкМ не предотвращало расслабление аорты под действием 100 мкМ 8-pMeOPT-2'-O-Me-cAMP (данные не приводятся). Следует

Рис.5. Оценка влияния ингибитора протеинкиназы G Rp-8Br-cGMPS (100 мкМ) на расслабляющее действие активатора белков Epac 8-pCPT-2'-O-Me-cAMP (100 мкМ) и нитроглицерина. Нитроглицерин использовали в концентрациях 11, 22, 44, 110 нМ и 4,4 мкМ. Добавление нитроглицерина обозначено тонкими стрелками. Аорту предсокращали путем добавления 0,1 мкМ фенилэфрина (ФЭ).

отметить, что данный ингибитор протеинкиназы А в концентрации 100 мкМ уменьшал релаксирующее действие форсколина (рис.2).

Важнейший механизм релаксации сосудов реализуется через NO/цГMФ-сигнальный путь. Если расслабление при участии белков Epac каким-то образом сопряжено с этим сигнальным путем, то эффект активаторов Epac на сосуды можно заблокировать при помощи селективного ингибитора цГМФ-активируемой протеинкиназы G. Для проверки этой гипотезы нами было исследовано влияние ингибитора цГМФ-активируемой протеинкиназы Rp-8-бромогуанозин-3',5'-циклического монофосфоротиоата (Rp-8-Br-cGMPS) на вызываемое активатором белков Epac 8-CPT-2'-O-Me-cAMP расслабление аорты. Как видно на рисунке 5, в присутствии ингибитора протеинкиназы G расслабление аорты под влиянием 8-CPT-2'-O-Me-cAMP было таким же, как в контрольном эксперименте. Для того, чтобы проверить, эффективен ли используемый ингибитор протеинкиназы G в условиях нашего эксперимента, было определено его действие на эффект донора NO – нитроглицерина. Оказалось, что ингибитор цГМФ-активируемой протеинкиназы подавлял действие нитроглицерина, делая его эффект обратимым (рис.5). Полученные результаты говорят о том, что расслабление аорты при действии активаторов белков Epac не связано с NO/цГМФ-сигнальным путем.

Таким образом, поставленные нами контрольные эксперименты доказывают, что действие 8-pMeOPT-2'-O-Me-cAMP и 8-CPT-2'-O-Me-cAMP специфично, и именно один из белков или оба белка Epac вызывают расслабление аорты. Вопрос о том, каков механизм действия этих белков, остается пока открытым. Можно предположить, что они действуют непосредственно в гладкомышечных клетках, подавляя вызванный вазоконстрикторными гормонами или нейротрансмиттерами подъем [Ca2+]цит, вызывают эндотелий-зависимое расслабление сосудов или ингибируют Са-независимый механизм сокращения гладких мышц сосудов.

Исследование влияния цАМФ на повышение концентрации кальция в гладкомышечных клетках сосудов под действием серотонина

Расслабление сосудов, предсокращенных гормонами или другими вазоактивными веществами, может происходить в результате ингибирования подъема уровня цитоплазматического кальция ([Ca2+]цит), вызванного вазоконстрикторами в гладкомышечных клетках (ГМК). Известно, что серотонин является мощным индуктором, повышающим уровень цитоплазматического кальция в ГМК. Мы оценивали влияние цАМФ на уровень повышения кальция под действием серотонина, регистрируя изменение концентрации [Ca2+]цит при помощи флуоресцентного зонда Fura-2. В контрольном эксперименте повторное добавление серотонина через 20 минут после первой добавки практически не снижало амплитуду кальциевого сигнала (рис. 6А). Однако после преинкубации клеток в течение 10 минут с 10 мкМ форсколина перед повторным добавлением серотонина амплитуда кальциевого сигнала уменьшалась более, чем в два раза (рис. 6 Б,В)

Рис.6. Влияние форсколина на повышение концентрации цитоплазматического кальция вызванной серотонином. А,Б - кинетика изменения [Ca2+]цит. В гладкомышечных клетках без преинкубации (А) и с преинкубацией с форсколином (Б). В- изменения реакции клеток при повторном добавлении в отсутствии и в присутствие форсколина. Концентрация серотонина составляла 10 мкМ, концентрация форсколина -10 мкМ. n – количество клеток.

Таким образом, можно предположить, что одним из механизмов действия цАМФ приводящим к расслаблению сосудов является ингибирование повышения концентрации цитоплазматического кальция в гладкомышечных клетках аорты крысы.

Исследование механизмов действия цАМФ на сократимость сердца

Влияние форсколина на сокращение сердца виноградной улитки

Для изучения цАМФ-зависимых механизмов регуляции сократимости сердца и роли белков Epac мы выбрали хорошо охарактеризованный в нашей лаборатории объект - сердце виноградной улитки Helix pomatia. Сердце улитки является чрезвычайно удобным объектом для проведения физиологических экспериментов, поскольку оно способно часами стабильно самопроизвольно сокращаться, а при хранении при 4оС сохраняет жизнеспособность в течение нескольких суток. В отличие от млекопитающих, у моллюсков активацию сократимости сердца вызывает серотонин, а не катехоламины. В активации сокращений сердца серотонином участвует цАМФ (Wollemann and Rozsa, 1975), однако детали этого процесса и механизмы действия цАМФ не исследованы. Влияние возрастающих концентраций серотонина на сокращения сердца виноградной улитки показано на рис. 7. Серотонин влияет на амплитуду сокращений и, как правило, не приводит к изменению частоты сокращения сердца.

Рис.7. Активация серотонином (5-HT) сокращения сердца виноградной улитки H.pomatia.

R-раствор Рингера. Концентрацию серотонина увеличивали путем смены раствора в канюле, к которой был прикреплен изолированный желудочек сердца улитки.

Мы убедились что серотонин активирует синтез цАМФ в мембранах, выделенных из сердца виноградной улитки (рис.8). Для того, чтобы оценить влияние цАМФ на сократимость сердца улитки, был использован активатор аденилатциклазы форсколин. Он оказывает значительно более сильный, по

Рис.8. Влияние серотонина и форсколина на активность аденилатциклазы в мембранах сердца виноградной улитки.

Рис.9. Влияние форсколина (А) и серотонина (Б) на амплитуду сокращений желудочка сердца виноградной улитки.

сравнению с серотонином, стимулирующий эффект на аденилатциклазу в мембранах, выделенных из сердца улитки (рис.8). Однако при сравнении влияния серотонина и форсколина на сократимость изолированного сердца улитки оказалось, что действие последнего значительно слабее (рис.9).

Исследование роли протеинкиназы А и белков Epac в проявлении активирующего действия цАМФ на сократимость сердца

Возникает вопрос о том, какова функция цАМФ в регуляции сократимости сердца. Из приведенных ранее данных (рис.9) видно, что просто повышение уровня цАМФ в сердце не приводит к сильному увеличению сократимости: эффект форсколина значительно слабее эффекта серотонина. Мы предположили, что в сердце моллюсков при воздействии серотонина реализуются цАМФ-зависимый и цАМФ-независимый механизмы активации сократимости. Для оценки влияния цАМФ на сократимость сердца улитки и выяснения механизмов его действия были использованы проникающие через мембрану аналоги цАМФ, селективно активирующие протеинкиназу А и белки Epac, Sp-8-Br-cAMPS и 8-CPT-2'-O-Me-cAMP, соответственно. На рис.10 показано, что преинкубация изолированного сердца с каждым из этих соединений достоверно увеличивает амплитуду реакции сердца на серотонин. Ни одно из них в отсутствие серотонина не увеличивает амплитуду сокращения сердца.

Рис.10. Влияние 8-CPT-2'-O-Me-cAMP и 8-Br-cAMPS на вызываемое серотонином увеличение амплитуды сокращения сердца виноградной улитки. Зависимости амплитуды сокращения сердца от концентрации серотонина определяли в контрольных условиях (нижние кривые) и в присутствии 8-pMeOPT-2'-O-Me-cAMP и Sp-8-Br-cAMPS в концентрациях 100 мкМ и 200 мкМ, соответственно. Данные соединения добавляли к сердцу за 20 минут до серотонина. Дозовые зависимости от серотонина (5-НТ) в контрольных условиях определяли за 40 минут до преинкубации сердец с аналогами цАМФ. В отдельных экспериментах показано, что без преинкубации с активаторами протеинкиназы А и белков Epac реакция на серотонин не изменяется.

Причина этого пока не установлена. Можно предполагать, что для усиления сократимости при действии цАМФ необходима одновременная стимуляция протеинкиназы А и белков Epac.

Активация сокращения сердца улитки серотонином через рецепторы, не сопряженные с аденилатциклазой

Приведенные выше данные говорят о том, что цАМФ не является основным фактором, регулирующим сердечную деятельность у виноградной улитки. При действии серотонина реализуется также другой, независимый от цАМФ механизм активации сократимости сердца. Мы предположили что в сердце виноградной улитки существует несколько видов рецепторов серотонина, активирующих сердце. О существовании более чем одного вида рецепторов серотонина в сердце улитки говорит тот факт, что зависимость амплитуды сократимости сердца от концентрации серотонина при анализе в координатах Скетчарда представляет из себя вогнутую двухфазную кривую (рис.11).

Рис. 11. Зависимость амплитуды сокращения сердца от концентрации серотонина представленная в координатах Скетчарда. По оси абцисс отложена величина амплитуды сокращений, выраженная в процентах от максимальной. По оси ординат отложено отношение амплитуды сокращения (%) к концентрации серотонина в нМ.

Для млекопитающих показано наличие 7 типов серотониновых рецепторов, большинство из которых сопряжены с G белками и влияют на активность аденилатциклазы и фосфолипазы С. Из этих семи типов 5НТ-рецепторов только 5HT3-рецепторы не сопряжены с G-белками и являются ионными каналами, через которые осуществляется транспорт катионов (Aghajanian and Sanders-Bush, 1999). Серотониновые рецепторы улитки не изучены, но, по аналогии с млекопитающими, мы предположили, что в реализации действия серотонина на сердце принимают участие различные типы серотониновых рецепторов, включая 5НТ3. В связи с этим было исследовано действие агониста серотониновых рецепторов третьего типа 5-HTQ (иодида N,N,N-триметил-серотонина). Оказалось, что действие 5-HTQ на сердце улитки вызывает дозозависимое увеличение амплитуды сокращения сердца (рис.12). Помимо этого, специфический антагонист 5HT3-рецепторов 3-тропонил-3,5-дихлорбензоат при концентарции 50 мкМ подавляет реакцию сердца на серотонин. Эти данные доказывают, что в сердце виноградной улитки имеются рецепторы, родственные 5HT3-рецепторам млекопитающих, которые, в отличие от всех остальных рецепторов серотонина, не сопряжены с G-белками и относятся к типу ионотропных рецепторов. Таким образом, существует путь регуляции сократимости сердца который не зависит от цАМФ.

Рис. 12. Увеличение амплитуды сокращения сердца под действием агониста 5HT3 рецепторов 5-HTQ (А) и ингибирование эффекта серотонина блокатором 5HT3-рецепторов 3-тропонил-3,5-дихлорбензоатом (Тр) (Б). Слева приведены контрольные зависимости амплитуды сокращений от концентрации серотонина. При определении действия блокатора 5НТ3-рецепторов его добавляли в концентрации 50 мкМ в отсутствие серотонина, а затем добавляли возрастающие концентрации серотонина одновременно с блокатором (Б, правая часть). R – раствор Рингера.

цАМФ независимый механизм регуляции сократимости сердца улитки тромбином

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»