WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 |

На правах рукописи

СУХАНОВА ИРИНА ФЕДОРОВНА

РОЛЬ цАМФСВЯЗЫВАЮЩИХ БЕЛКОВ EPAC В РЕГУЛЯЦИИ СОКРАТИМОСТИ КРОВЕНОСНЫХ СОСУДОВ И СЕРДЦА

03.00.13 физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва - 2007

Работа выполнена в лаборатории общей физиологии им. Х.С.Коштоянца Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН.

Научный руководитель:

доктор биологических наук Павел Владимирович Авдонин

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук

Игорь Сергеевич Захаров

доктор биологических наук

Андрей Андреевич Галкин

Ведущее учреждение:

Иститут сравнительной биохимии и физиологии им. И.М. Сеченова РАН, г.Санкт-Петербург

Автореферат разослан « » апреля 2007 года

Защита диссертации состоится «23» мая 2007 года в 1100 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.238.01 при Институте биологии развития им.Н.К. Кольцова РАН (119334, Москва, улица Вавилова, дом 26).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Факс: (495) 135 – 80 – 12

E-mail: volina46@bk.ru

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д 002.238.01,

кандидат биологических наук Волина Е.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. цАМФ был открыт в конце 50-х годов прошлого века как вторичный посредник, передающий сигналы в клетку от множества гормонов, нейротрансмиттеров, простагландинов, ряда других субстанций, которые активируют аденилатциклазу. До недавнего времени считалось, что универсальным механизмом действия цАМФ является активация протеинкиназы А. В 1998 г. были обнаружены новые внутриклеточные мишени цАМФ – белки Epac1 и Epac2 (Exchange Proteins Activated by cAMP). Они широко распространены в организме и по крайней мере один из этих белков, Epac1, выявлен во всех исследованных тканях. Связывая цАМФ, белки Epac взаимодействуют с низкомолекулярными G-белками Rap1A/2B и стимулируют замещение ГДФ на ГТФ в их регуляторном центре, поэтому их обозначают также как cAMP-GEF (guanine nucleotide exchange factor). Белки Rap активируют протеинкиназу B-Raf, которая, в свою очередь, активирует протеинкиназный каскад MEK/Erk. Несколько позднее было установлено, что помимо Rap, белки Epac активируют специфичную к фосфоинозитидам фосфолипазу С-, KATP-каналы, влияют на функционирование хлорных каналов (Holz, 2006). В кардиомиоцитах мыши выявлен макромолекулярный комплекс Epac1 с рианодиновыми рецепторами, протеинкиназой А и фосфодиэстеразой цАМФ (Dodge-Kafka et al., 2005).

Изучение роли белков Epac в регуляции цАМФ-зависимых физиологических процессов находится на начальной стадии. Показано, что, наряду с протеинкиназой А, белки Epac активируют секрецию, влияют на межклеточные взаимодействия, процессы дифференцировки и апоптоза, принимают участие в регуляции ионных каналов и передачи сигнала в синапсе. (Holz, 2006). цАМФ играет ключевую роль в регуляции работы сердца и всей сердечно-сосудистой системы, вызывая расслабление кровеносных сосудов (Kotlikoff, 1996) и стимуляцию сократимости сердца (Kammerer, 2003). Доказано, что в реализации этих эффектов цАМФ участвует протеинкиназа А, однако роль белков Epac в проявлении действия цАМФ на сосуды и сердце не исследовалась.

Цель и задачи исследования. Настоящая работа посвящена изучению механизмов цАМФ-зависимой регуляции сократимости сосудов и сердца и выяснению роли белков Epac в проявлении действия цАМФ на эти органы.

В работы были поставлены следующие задачи:

  1. Определить, участвуют ли белки Epac в цАМФ-зависимой регуляции сосудистого тонуса.
  2. Оценить специфичность действия аналогов цАМФ, использованных для активации белков Epac.
  3. Исследовать влияние цАМФ на кальциевый обмен в культивируемых гладкомышечных клетках аорты крысы.
  4. Оценить роль белков Epac и протеинкиназы А в цАМФ-опосредованной регуляции сократимости сердца, используя в качестве модели изолированное сердце виноградной улитки Helix pomatia.
  5. Исследовать на модели изолированного сердца виноградной улитки цАМФ-независимые пути активации сердечной сократимости.

Научная новизна и практическая значимость работы. Установлено, что расслабление аорты крысы, вызванное цАМФ, опосредовано активацией не только протеинкиназы А, но и белков Epac. Показано, что одним из механизмов цАМФ-индуцированного расслабления кровеносных сосудов является подавление повышения концентрации ионов кальция в цитоплазме гладкомышечных клеток в ответ на вазоконстрикторные стимулы.

Показано, что подавление под влиянием цАМФ агрегации тромбоцитов, индуцированной АДФ, опосредовано протеинкиназой А без участия белков Epac.

Обнаружено, что активаторы белков Epac и протеинкиназы А увеличивают амплитуду вызванного серотонином сокращения сердца виноградной улитки Helix pomatia. Это свидетельствует об участии данных мишеней цАМФ в регуляции сократимости сердца. Установлено, что активация сократимости сердца виноградной улитки H.pomatia, вызванная серотонином, опосредована двумя видами рецепторов. Рецепторы одного вида сопряжены с аденилатциклазой и повышают уровень цАМФ. Второй вид подобен 5НТ3-рецепторам, относящимся к типу ионотропных рецепторов и активирующих сердце по цАМФ-независимому механизму.

Установлено, что цАМФ-независимый механизм реализуется при активации сокращений сердца виноградной улитки тромбином. Полученные данные свидетельствуют, что тромбин активирует в сердце улитки рецепторы, гомологичные активируемым протеазами рецепторам 1-го и 4-го типов млекопитающих.

Проведенные исследования расширяют представления о биохимических основах работы сердечно-сосудистой системы. Они создают предпосылки для более детального изучения механизмов действия на сосуды и сердце гормонов и нейротрансмиттеров, связывающихся с рецепторами, активирующими аденилатциклазу. Полученные результаты могут иметь значение при разработке научно обоснованных подходов к лечению сердечно-сосудистых заболеваний, поскольку многие фармакологические препараты, влияющих на сердце и сосуды, оказывают свое действие через систему обмена цАМФ.

Публикация и апробация работы. По теме диссертации опубликованы 2 статьи. Результаты диссертации были представлены на 13-м международном совещании по эволюционной физиологии (СПб, 2006), на Международной конференции по простым нервным системам, (Казань, 2006) и на конференциях молодых ученых ИБР РАН (2005,2006).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на страницах и содержит рисунков и таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Аналоги цАМФ, избирательно действующие на белки Epac и протеинкиназу А

Основной подход, который применяется для изучения физиологических функций белков Epac, заключается в использовании аналогов цАМФ, избирательно активирующие белки Epac (Schwede et al, 2000, Kang et al, 2003). Специфические ингибиторы этих белков отсутствуют. В настоящей работе для активации белков Epac были использованы соединения 8-(4-метоксифенилтио)-2'-O-метиладенозин-цАМФ (8-pMeOPT-2'-O-Me-cAMP) и 8-(4-хлорофенилтио)-2’-О-метиладенозин-цАМФ (8-CPT-2'-O-Me-cAMP). Для избирательной активации и ингибирования протеинкиназы А применяли Sp-8-Br-cAMPS и Rp-8-Br-cAMPS, соответственно (рис.1).

Рис.1. Структура аналогов цАМФ, избирательно действующих на белки Epac и протеинкиназу А.

Измерение силы изометрического сокращения изолированных фрагментов аорты крысы

Измерение силы сокращения изолированных фрагментов грудного отдела аорты крысы при действии на них вазоактивных гормонов и нейротрансмиттеров проводили в изометрическом режиме (Кожевникова и соавт., 2006).

Культивирование гладкомышечных клеток аорты крысы

Гладкомышечные клетки выделяли из препаратов аорты крыс-самцов линии Wistar методом эксплантов. Для экспериментов использовали клетки 2-8 пассажей. Их культивировали в среде DMEM, содержащей 10% фетальной сыворотки теленка.

Измерение амплитуды сокращений изолированного сердца улитки

Исследования проводились в июле-сентябре на Кропотовской биологической станции Института биологии развития им.Н.К.Кольцова. В опытах использовали крупных виноградных улиток Helix pomatia с размером раковины 35-45 мм. Эксперименты проводили при температуре 23-25оС. Сокращения изолированного желудочка сердца H.pomatia регистрировали по ранее описанному методу в изотоническом режиме (Suslova, Solomonova et al, 2005). На рисунках показаны изменения амплитуды сокращений сердца.

Измерение активности аденилатциклазы в препаратах мембраны сердца улитки

Для выделения мембран 10 свежепрепарированных сердец разрушали гомогенизатором типа “Политрон” в охлажденном до +4оС буфере (20 мМ трис-Cl, 1 мМ ЭДТА, pH 7,4), далее проводили центрифугирование при температуре +4оС в течение 1 часа при 100000g. Полученный осадок мембран ресуспендировали в этом же буфере. Активность аденилатциклазы определяли в среде объемом 50 мкл, содержащей 0,5-1 µCi [-32P]ATФ, 0,05 мМ ATФ, 1 мМ цAMФ, 10 мкМ ГTФ, 1 мМ MgCl2, 2 мМ креатинфосфата, 0,1 мг/мл креатинфосфокиназы, 10 мМ HEPES-Na (pH 7,2). Инкубацию проводили в течение 20 минут при 25 oC. Образовавшийся [32P]цAMФ отделяли от [-32P]ATФ и продуктов его распада путем хроматографии на колонках с Al2O3 (White, 1974).

Измерение агрегации тромбоцитов

Измерение агрегации проводили по изменению светопропускания по стандартному методу Борна на приборе фирмы «Биола» (Москва). Агрегацию индуцировали добавлением 5 мкМ АДФ. Для определения действия активаторов протеинкиназы А и белков Epac тромбоциты преинкубировали с этими веществами в течение 10 минут при 37 oC перед добавлением АДФ.

Измерение концентрации цитоплазматического кальция с помощью флуоресцентного зонда Fura-2

Для измерения концентрации цитоплазматического кальция использовались клетки 2-8 пассажей. Прокраску клеток проводили с 8 мкМ Fura-2(АМ) в присутствии 0,0002% Pluronic в течение 40 минут при температуре 23-25 oC. Измерение цитоплазматической концентрации кальция проводили на инвертированном микроскопе Nikon оборудованном CCD камерой CoolSnap-fx (“Roper Scientific”,США). Данные, полученные при помощи Ca2+ чувствительного зонда Fura-2 представлены как отношение интенсивностей флуоресценции, возбуждаемой при длинах волн 340 и 380 нм (F340/F380). Все растворы готовили на буфере состава (мМ): NaCl – 145; KCl – 5; MgCl2 – 1; CaCl2 – 1; Hepes – 5; D-глюкоза – 10 (pH = 7,4 при 25°С) и добавляли путем полной замены раствора в камере с клетками.

Статистическая обработка результатов

Статистическая обработка данных проводилась в программе MS Exel. При оценке достоверности различий показателей использовали t- критерий Стьюдента. Различия считались достоверными при p < 0,05.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

Исследование механизмов действия цАМФ на сократимость сосудов

Влияние форсколина и аналогов цАМФ, активирующих белки Epac и протеинкиназу А, на сократимость изолированной аорты крысы

Для того, чтобы оценить влияние цАМФ на сократимость сосудов был использован активатор аденилатциклазы форсколин. На рис.2 показано, что форсколин (0,2 мкМ) вызывает расслабление изолированной аорты, предсокращенной норадреналином. Высокоселективный ингибитор протеинкиназы А Rp-8-Br-cAMPS почти полностью снимал расслабляющий эффект форсколина (рис.2В). Однако при повторном добавлении к сосудам более высокой концентрации форсколина (0,4 мкМ) его расслабляющее действие на аорту вновь проявлялось. Причем в данном случае расслабление происходило более медленно, чем в контроле при использовании меньшей концентрации форсколина (рис.2Б). Ингибитор протеинкиназы А (Rp-8-Br-cAMPS) является конкурентным по отношению к цАМФ. Поэтому при

Рис 2. Расслабление изолированной аорты, вызванное форсколином (Ф) и влияние селективного ингибитора протеинкиназы А Rp-8-Br-cAMPS (R) на действие форсколина. Форсколин применяли в концентрациях 0,2 мкМ (Б), 0,2 и 0,4 мкМ (В). Концентрация Rp-8-Br-cAMPS составляла 100 мкМ, норадреналина (НА) – 10 мкМ.

увеличении концентрации форсколина до 0,4 мкМ уровень цАМФ в клетке возрастает в большей степени, что может приводить к вытеснению Rp-8-Br-cAMPS из участка связывания на регуляторной субъединице протеинкиназы А.

В то же время нельзя исключить и существования альтернативного цАМФ-зависимого механизма расслабления, который реализуется при более высокой концентрации цАМФ, чем требуется для активации протеинкиназы А. Мы предположили, что белки Epac принимают участие в процессе цАМФ-зависимого расслабления сосудов. Для оценки возможного влияния белков Epac на сократимость аорты были использованы высокоизбирательные активаторы этих белков - 8-pMeOPT-2'-O-Me-cAMP и 8-CPT-2'-O-Me-cAMP.

Рис.3. Расслабление кольца аорты крысы под влиянием активаторов белков Epac и протеинкиназы А. Показано влияние 8-pMeOPT-2'-O-Me-cAMP (100 мкМ) и Sp-8-Br-cAMPS (40 мкМ) на сокращение аорты, вызванное норадреналином (А,В) и влияние 8-pCPT-2'-O-Me-cAMP (100 мкМ) на сокращение вызванное фенилэфрином. Концентрации норадреналина (НА) и фенилэфрина (ФЭ) сотавляли 0,1 мкМ.

Оказалось, что эти соединения вызывают расслабление аорты, предсокращенной норадреналином и фенилэфрином (рис.3А,Б).

Расслабление аорты наступает также при избирательной активации протеинкиназы А с помощью селективного активатора этого фермента Sp-8-Br-cAMPS (рис 3В).

Pages:     || 2 | 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»