WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 ||

Рис. 6. Вестерн-блоты белков фракций 26S-протеасом (а, б, в, г) и 20S-протеасом (д, е, ж, з), полученных из селезенки, печени, легких и асцитной карциномы Krebs-II мыши. Использованы моноклональные антитела к субъединицам Rpt6 (а, д) и альфа1,2,3,5,6,7 (б, е) и поликлональные антитела к субъединицам LMP7 (в, ж) и LMP2 (г, з). Маркеры: овальбумин (М.м. 45 кДа), карбоангидраза (М.м. 29 кДа), ингибитор трипсина (М.м. 20 кДа).

отмечают несоответствие результатов, полученных ими при анализе уровня мРНК иммунной субъединицы LMP2 и исследовании этой субъединицы Вестерн-блоттингом в клеточной линии почечной карциномы мыши (Seliger et al., 2000). Мы полагаем, что более корректный подход заключается в сравнении уровня и мРНК, и белка в опухолевых и контрольных клетках. Это тем более важно потому, что в разных клетках соотношение субтипов иммунных протеасом различно. Как мы показали в данной работе, в здоровых клетках легких мыши уровень субъединицы LMP2 существенно ниже уровня субъединицы LMP7 (рис. 6 в, г). Если проводить исследование опухолей без учета особенностей контрольных клеток, можно придти к неверным выводам. Тем не менее, серия указанных статей дает основание полагать, что резкое сокращение количества иммунных субъединиц протеасом в асцитной карциноме Krebs-II мыши обусловлено скорее низким уровнем мРНК, чем подавлением их синтеза или посттрансляционными процессами. Это предположение очерчивает пути поиска механизмов, определяющих количественный уровень иммунных протеасом, в направлении исследования регуляции транскрипции генов, кодирующих иммунные субъединицы.

Конститутивные 26S-протеасомы. Функции конститутивных 26S-протеасом заключаются в регуляции множества клеточных процессов посредством АТФ- и убиквитинзависимого гидролиза белков-участников этих процессов. Мы обнаружили, что пул 26S-протеасом в асцитной карциноме Krebs-II мыши вдвое больше, чем в контрольных клетках легких (рис. 6 а, б). Если принять во внимание крайне низкое содержание в нем иммунных субъединиц, то можно сказать, что этот пул представлен, главным образом, конститутивными протеасомами. Активность химотрипсинподобных центров рассматриваемого пула протеасом в семь раз выше, чем в контрольных клетках. Возникает закономерный вопрос, для чего злокачественной опухоли нужен увеличенный пул столь активных конститутивных 26S-протеасом Клетки злокачественных опухолей отличаются от контрольных клеток активным обменом белков. Для его осуществления, очевидно, и требуется более активный пул 26S-протеасом. Высокая активность этого пула поддерживается не только увеличением количества 26S-протеасом, но и изменением субъединичного состава – исключением из него иммунных субъединиц. Иными словами, исключение иммунных субъединиц из пула 26S-протеасом позволяет злокачественным клеткам добиваться двух целей: «уходить» из-под иммунного надзора и повышать активность конститутивных протеасом, обеспечивающих их жизнедеятельность.

Пул 20S-протеасом клеток асцитной карциномы Krebs-II мыши подобен пулу 20S контрольных клеток легких по относительному количеству, по субъединичному составу (рис. 6е) и по активности протеасом. Это сходство представляется логичным, поскольку эта форма протеасом не участвует ни в регуляторном процесссе, ни в иммунном ответе. Пул 20S-протеасом в асцитной карциноме и здоровых органах взрослой мыши не имеет в своем составе иммунных субъединиц, в отличие от таковых в органах крысы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты данного исследования являются оригинальными, вносят значимый вклад в биологию развития и открывают перспективы в изучении физиологической роли протеасом.

Установленные нами факты о 1) формировании иммунных протеасом в селезенке и печени в разные сроки постнатального развития и 2) образовании четких периартериальных лимфоидных оболочек белой пульпы селезенки одновременно с появлением иммунных протеасом в печени являются важными в понимании развития иммунной системы млекопитающих. Они позволяют понять механизм складывающихся в организме взаимоотношений лимфоидных и находящихся под их защитой нелимфоидных органов. В этой связи начатая нами работа определяет необходимость дальнейших исследований динамики появления иммунных протеасом в других лимфоидных и нелимфоидных органах, а также распределения иммунных протеасом в различных клетках этих органов.

В огромном количестве публикаций, вышедших за последнее время, нет ни одной работы, в которой было бы проведено детальное исследование пула протеасом в злокачественно трансформированных клетках. Актуальность таких работ очевидна, хотя бы потому, что до сих пор не совсем понятен механизм, с помощью которого злокачественно трансформированные клетки «обманывают» иммунную систему. Одна из особенностей асцитной карциномы Krebs-II мыши – исключение иммунных протеасом из клеточного пула – позволяет клеткам опухоли «уйти» из-под иммунного надзора. Является ли исключение иммунных протеасом общим для всех или большинства злокачественно трансформированных клеток свойством Ответ на этот вопрос мы надеемся получить в дальнейших исследованиях. Очень важно, на наш взгляд, изучение механизмов регуляции экспрессии иммунных субъединиц протеасом. Эти знания могут помочь найти пути восстановления их уровня, необходимого и достаточного для распознавания злокачественных клеток иммунной системой.

Данная работа полностью выполнена в Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (гранты № № 03-04-49127, 06-04-48229).

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод разделения пулов 26S- и 20S-протеасом для их сравнительного анализа в различных органах. Метод включает в себя фракционирование белков осветленных гомогенатов органов сульфатом аммония и позволяет сохранить оба пула в нативном состоянии.

2. В первые три недели постнатального развития в селезенке и печени крысы дважды происходит смена пулов 26S- и 20S-протеасом. При этом качественно новые пулы протеасом, содержащие иммунные субъединицы, в селезенке формируются раньше, чем в печени.

3. Образование четко выраженных муфт белой пульпы селезенки крысы к 15-18 сут постнатального развития совпадает по времени с появлением иммунных протеасом в печени.

4. Пул 26S-протеасом в клетках асцитной карциномы Krebs-II мыши превышает таковой в контрольных клетках легких вдвое; активность химотрипсинподобных центров протеасом этого пула в 7 раз выше, чем в клетках легких.

5. Уровень иммунной субъединицы LMP7 в пуле 26S-протеасом в клетках асцитной карциномы Krebs-II мыши в 12 раз ниже в сравнении с таковым в клетках легких. Иммунная субъединица LMP2 в этом пуле не выявляется в отличие от пула 26S-протеасом клеток легких.

6. 20S-протеасомы клеток асцитной карциномы Krebs-II мыши не отличаются от 20S-протеасом клеток легких по активности, количеству и субъединичному составу.

Выражаю благодарность своим учителям академику Збарскому И.Б., ст.н.сотр. Бульдяевой Т.В., в.н.сотр. Кузьминой С.Н., с которыми связаны первые шаги в науке и большая интересная работа и жизнь в лаборатории. Научному руководителю Шаровой Н.П. за постоянную помощь в проведении экспериментов, обсуждении результатов, за терпение и душевную щедрость. Коллегам Михайлову В.С., Пескину А.В., Абрамовой Е.Б., Акопову С.Б., Столярову С.Д., Дмитриевой С.Б., Гореловой В.С., Ерохову П.А., Бондаревой Л.А. за участие в проведении экспериментов, помощь в оформлении иллюстративного материала и моральную поддержку. А также всем сотрудникам Института, выразившим интерес к работе. Своей семье, отнесшейся ко мне с большим вниманием в период оформления работы.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах:

1. Е.Б.Абрамова, Т.М.Астахова, П.А.Ерохов, Н.П.Шарова. Множественность форм протеасомы и некоторые подходы к их разделению // Известия РАН. Серия биологическая. 2004. –№ 2. –С. 150-156.

2. Е.Б.Абрамова, Т.М.Астахова, Н.П.Шарова. Изменение активности и состава протеасом в постнатальном развитии крысы // Онтогенез. 2005. –Т. 36 –№ 3. –С. 205-210.

3. Н.П.Шарова, Т.М.Астахова, Л.А.Бондарева, С.Б.Дмитриева, П.А.Ерохов. Особенности формирования пулов протеасом в селезенке и печени крысы в постнатальном развитии // Биохимия. 2006. –Т. 71. –вып. 9. –С.1278-1286.

4. Т.М.Астахова, Н.П.Шарова. Исключение иммунных протеасом из клеток асцитной карциномы Krebs-II // Известия РАН. Серия биологическая. 2006. –№ 3. –С. 275-283.

5. Н.П.Шарова, Т.М.Астахова, Л.А.Бондарева, С.Б.Дмитриева, С.Д.Столяров. Формирование иммунных протеасом и развитие иммунной системы в онтогенезе млекопитающих // Онтогенез. 2007. –Т. 38, в печати.

Тезисы:

1. Abramova E.B., Astakhova T.M., Bondareva L.A., Stolyarov S.D., Sharova N.P. Changes in proteasome pool in postnatal development of rat. Abstracts at the 15th International Society of Developmental Biologists Congress. 3-7 September 2005. Sydney, Australia. –P. 79.

2. Н.П.Шарова, Т.М.Астахова, Л.А.Бондарева, С.Б.Дмитриева, С.Д.Столяров. Иммунные протеасомы и иммунитет // Материалы конференции, посвященной 80-летию со дня рождения А.А.Нейфаха «Молекулярные механизмы процессов онтогенеза: эмбриогенез, геномы, эволюция». Москва, 15-16 мая 2006 г. –С. 11.

3. Шарова Н.П., Астахова Т.М., Дмитриева С.Б., Мельникова В.И., Бондарева Л.А., Афанасьева М.А., Карпова Я.Д. Изменение пулов 26S- и 20S-протеасом и становление иммунитета в постнатальном развитии млекопитающих // Тезисы докладов VI симпозиума «Химия протеолитических ферментов». Москва, 23-25 апреля 2007. –В печати.

Pages:     | 1 | 2 ||






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»