WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 |

Динамика удельной активности пулов 26S- и 20S-протеасом в селезенке и печени крысы в постнатальном развитии показана на рис. 1. Удельная активность выражена в единицах на мг белка, содержащегося в осветленных гомогенатах селезенки и печени. Результаты исследования, отображенные на этом рисунке показывают, что в первые три недели постнатального развития активность пула 26S- (рис. 1а) и пула 20S-протеасом (рис. 1б) в селезенке (1) и печени (2) крысы падает дважды. Первый период падения активности начинается с 7-х сут, длится дольше по сравнению со вторым, минимальные значения активности в этом пике приходятся на 11-е сут. Второй минимум падения активности приходится на 19 сут постнатального развития.

Относительное количество 26S- и 20S-протеасом. Относительное количество 26S-протеасом в селезенке и печени на разных этапах развития оценивали с помощью Вестерн-блоттинга белков полученных фракций 1 и 2 с использованием моноклональных антител к субъединице Rpt6 (М.м. 46 кДа), входящей в состав регуляторной субъединицы 19S (рис. 2а). Из рисунка следует, что Rpt6 обнаруживается только в 26S пуле (блоты: 1 – селезенка, 3 – печень) и отсутствует в 20S пуле (блоты: 2 – селезенка, 4 – печень). То незначительное количество субъединицы Rpt6, которое выявляется во фракции 20S-протеасом на 21-е и 23-е сут, скорее всего, принадлежит 19S-субчастицам, не связанным с протеасомами.

Относительное количество 20S-протеасом определяли во фракции 2 тем же методом с использованием моноклональных антител к субъединицам 1,2,3,5,6,7 (29-32 кДа), входящим в состав -колец (рис. 3а, блоты: 1 – селезенка, 2 – печень).

После выявления специфических полос на рентгеновской пленке стандартной реакцией хемилюминесценции определяли их плотность и пересчитывали ее на мг белка осветленных гомогенатов. Результаты оценки относительного количества 26S- и 20S-протеасом в селезенке (1) и печени (2) представлены на рис. 2б и на рис. 3б соответственно. Динамика количества протеасом в пуле 26S в селезенке и печени крысы в постнатальном развитии имеет сходство с динамикой их удельной активности: периоды падения активности и содержания протеасом совпадают, однако строгой корреляции между этими величинами не наблюдается (рис. 2б и 1а). Для 20S-протеасом выявлена иная картина: их количество и в селезенке, и в печени не имеет достоверных различий на разных этапах развития (рис. 3б).

Рис. 1. Удельная активность пулов 26S-протеасом (а) и 20S-протеасом (б), выделенных из селезенки (1) и печени (2) крыс разного возраста. Приведен доверительный интервал при уровне значимости р<0,05.

Рис. 2. Содержание субъединицы Rpt6 во фракциях селезенки и печени крыс разного возраста.

а – Вестерн-блоты белков фракций 26S-протеасом (1, 3) и 20S-протеасом (2, 4), полученных из селезенки (1, 2) и печени (3, 4), с использованием моноклональных антител к субъединице Rpt6. Маркер – овальбумин (М.м. 45 кДа).

б – Относительное количество субъединицы Rpt6 во фракциях 26S-протеасом, полученных из селезенки (1) и печени (2). За 100% принято количество Rpt6 в органах пятисуточных крыс. Приведен доверительный интервал при уровне значимости р<0,05.

Рис. 3. Содержание субъединиц альфа1,2,3,5,6,7 во фракциях селезенки и печени крыс разного возраста.

а – Вестерн-блоты белков фракций 20S-протеасом, полученных из селезенки (1) и печени (2), с использованием моноклональных антител к субъединицам альфа1,2,3,5,6,7. Маркер – карбоангидраза (М.м. 29 кДа).

б – Относительное количество субъединиц альфа1,2,3,5,6,7 во фракциях 20S-протеасом, полученных из селезенки (1) и печени (2). За 100% принято количество альфа1,2,3,5,6,7 в органах пятисуточных крыс. Приведен доверительный интервал при уровне значимости р<0,05.

Динамика появления иммунных субъединиц в пулах 26S- и 20S-протеасом в селезенке и печени крысы в постнатальном развитии отражена

на рис. 4.

Замена конститутивных субъединиц на иммунные происходит во вновь образующихся протеасомах при определенных условиях, например, под воздействием ИФ (Rock, Goldberg, 1999). При этом конститутивные каталитические субъединицы X(5), Y (1) и Z(2) замещаются на иммунные субъединицы LMP7 (5i), LMP2 (1i) и LMP10 (2i). Субъединицы LMP2 и LMP10 встраиваются совместно, но независимо от LMP7. Включение LMP7, хотя и облегчается наличием LMP2 и LMP10, но может осуществляться и без них. Таким образом, в пулах протеасом наряду с конститутивными формируются и несколько субтипов иммунных протеасом. Какова их роль Гидролиз генетически чужеродных белков, своих мутантных или вирусных, осуществляют как конститутивные, так и иммунные протеасомы. Но при гидролизе этих белков иммунными протеасомами в несколько раз возрастает выход олигопептидов длиной 8-11 аминокислотных остатков с «правильным» С-концом, содержащим гидрофобные аминокислоты или аргинин. Олигопептиды такой длины соответствуют размерам антигенных эпитопов. В комплексе с молекулами ГКГ класса I они выносятся на поверхность дефектной клетки для представления Т-киллерам. Последние распознают такой комплекс и запускают апоптоз дефектных клеток. В АПК, таких как макрофаги и дендритные клетки, иммунные протеасомы участвуют в активации «наивных» Т-лимфоцитов в цитотоксические Т-лимфоциты, или Т-киллеры. Таким образом, иммунные протеасомы являются первичным звеном в формировании иммунного ответа.

Содержание иммунных субъединиц LMP7 (30 кДа) и LMP2 (23 кДа) в пулах протеасом селезенки и печени исследовали с помощью Вестерн-блоттинга с использованием поликлональных антител к этим субъединицам. По содержанию субъединицы LMP2 судили и о содержании включающейся вместе с ней субъединицы LMP10. Обе иммунные субъединицы, LMP7 и LMP2, выявляются данным методом в заметном количестве в селезенке на 7-е постнатальные сутки (рис. 4, блоты 1–4), причем как в пуле 26S-протеасом (рис. 4, блоты 1, 3), так и в пуле 20S-протеасом (рис. 4, блоты 2, 4). В печени же обе субъединицы выявляются в незначительном количестве только на 17-е сутки постнатального развития (рис. 4, блоты 5-8), на 19-е сутки содержание их возрастает и, как в селезенке, они входят в состав и 26S-протеасом (рис. 4, блоты 5, 7), и 20S-протеасом (рис. 4, блоты 6, 8).

В ходе обсуждения полученных результатов мы пришли к выводу, что параллельное падение активности и количества протеасом можно рассматривать как результат истощения запасенного 26S-пула.

Рис. 4. Вестерн-блоты белков фракций 26S-протеасом (1, 3, 5, 7) и 20S-протеасом (2, 4, 6, 8), полученных из селезенки (1–4) и печени (5–8) крыс разного возраста. Использовали поликлональные антитела к субъединицам LMP7 (1, 2, 5, 6) и LMP2 (3, 4, 7, 8). Маркеры – карбоангидраза (М.м. 29 кДа), ингибитор трипсина (М.м. 20 кДа).

Уменьшение пула 26S-протеасом начинается на 7-е постнатальные сутки. В это же время в пуле 26S-протеасом селезенки появляются иммунные субъединицы. Следовательно, на 7-е сут начинается и обратный процесс – формирование нового пула 26S-протеасом, причем в селезенке это уже качественно иной пул, включающий в себя иммунные субъединицы, в то время как в печени вновь образуется пул конститутивных 26S-протеасом. Через 12 сут (на 19-е постнатальные сутки) начинается следующий период смены пулов 26S в этих органах, который сопровождается падением активности и относительного количества протеасом и в печени, и в селезенке, а также появлением иммунных субъединиц в печени. Полученные результаты и сделанные нами выводы согласуются с тем фактом, что время полужизни протеасом составляет 12 сут (Tanaka, Ichihara, 1989). Отсутствие строгой корреляции между динамикой удельной активности и относительным количеством протеасом в пуле 26S можно объяснить одновременным осуществлением нескольких процессов – устранением старого и формированием нового пула, изменением субъединичного состава протеасом, действием регуляторных белков. Так, например, известно, что замена конститутивных каталитических субъединиц на иммунные сопровождается изменением активности протеасом (Eleuteri et al., 1997).

Смена пулов 20S-протеасом в селезенке и печени крысы в постнатальном развитии, по всей видимости, происходит одновременно со сменой пулов 26S-протеасом, о чем свидетельствует динамика их активности и появление в них иммунных субъединиц. Отсутствие видимого изменения количества 20S-протеасом не противоречит этому предположению и объясняется особенностями их сборки: формирование 20S-протеасом начинается с образования их неактивных предшественников (Coux et al., 1996).

Развитие белой пульпы селезенки в онтогенезе крысы.

В основе организации системы периферических органов иммунной системы лежит региональный принцип: каждый лимфоидный орган контролирует определенную часть тела (Ярилин, 1999). Печень находится в зоне иммунологического надзора селезенки. Поэтому параллельно с изучением динамики формирования иммунных протеасом в селезенке и печени крысы мы исследовали динамику развития белой пульпы селезенки, а именно, периартериальных лимфоидных оболочек (муфт), которые представляют собой функциональные зоны Т-лимфоцитов.

Срезы селезенки обрабатывали гематоксилин-эозином. Окрашивание этими красителями позволяет различать лимфоциты, обладающие крупными ядрами, среди всего многообразия клеток селезенки. На рис. 5 представлены фотографии срезов селезенки разных стадий развития, на

Рис. 5. Развитие белой пульпы селезенки крысы. Срезы окрашены гематоксилин-эозином. Увеличение: 10 Х. Стрелками обозначены зоны периартериальных лимфоидных оболочек.

которых прослеживается развитие муфт. На ранних стадиях развития Т- и В-лимфоциты в селезенке перемешаны, но в первые постнатальные дни растет количество зон концентрически расположенных клеток стромы в периартериальном пространстве белой пульпы, куда постепенно мигрируют Т-лимфоциты (Van Rees et al., 1990). Мы показали, что четко выраженные муфты вокруг артериол образуются к 15-18-м сут постнатального развития, что приблизительно совпадает по времени с началом формирования иммунных протеасом в печени (17-19-е сут) (рис. 4).

Установленные нами факты о 1) формировании иммунных протеасом в селезенке (лимфоидном органе) и печени (нелимфоидном органе) в первые три недели постнатального развития, 2) появлении иммунных протеасом в селезенке раньше, чем в печени, 3) образовании четких периартериальных лимфоидных оболочек белой пульпы селезенки одновременно с появлением иммунных протеасом в печени являются важными в понимании развития иммунной системы млекопитающих.

Клетки иммунной системы созревают уже в ходе эмбрионального развития. Однако функциональная активность клеток в эмбриональном и раннем постнатальном развитии выражена еще слабо. С одной стороны, данный факт можно объяснить незавершенной миграцией лимфоцитов во вторичные лимфоидные органы. Например, у крыс она продолжается в течение нескольких недель после рождения (Van Rees et al., 1990; Ярилин, 1999). С другой стороны, очевидно, что полноценный иммунный ответ невозможен без формирования всех компонентов, участвующих в развитии иммунных реакций. Результаты проведенной работы объясняют причину неэффективного функционирования иммунной системы в эмбриональном и раннем постнатальном развитии. Иммунные протеасомы, необходимые для запуска Т-клеточного иммунного ответа, выявляются в селезенке на первой неделе, а в печени – на третьей неделе после рождения. Иными словами, селезенка, по-видимому, готова к Т-клеточному иммунному ответу внутри самой себя к концу первой недели постнатального развития, когда в ней формируются иммунные протеасомы и уже присутствуют Т-лимфоциты и АПК. Более раннее обеспечение иммунной защиты селезенки как органа иммунной системы представлется важным для становления иммунитета в целом. Печень, находящаяся в зоне иммунной защиты селезенки, способна представить свои дефектные клетки к 17-19 сут постнатального развития, когда цитотоксические Т-лимфоциты могут перемещаться из белой пульпы селезенки с током крови и/или лимфы и уничтожать эти клетки.

Особенности пула протеасом в клетках асцитной карциномы Krebs-II мыши.

Соотношение между формами и субтипами протеасом (26S, 20S, конститутивными и иммуными) во многом определяет функции органов и тканей, в том числе злокачественно трансформированных. В данном разделе работы приводятся результаты анализа пула 26S- и пула 20S-протеасом клеток асцитной карциномы Krebs-II мыши с таковыми клеток различных органов здоровых животных.

Клетки асцитной карциномы Krebs-II прививали мышам линии Balb/c. Асцитная карцинома Krebs/II – экспериментальная опухоль, полученная из

эпителиальных клеток мыши. Для сравнения с карциномой исследовали органы здоровых мышей: легкие, состоящие в основном из эпителиальных клеток и представляющие корректный контроль, а также селезенку и печень – органы иного гистологического строения.

Иммунные 26S-протеасомы. В связи с известным свойством злокачественных клеток преодолевать иммуннологический контроль, наш интерес, прежде всего, был направлен на изучение уровня иммунных субъединиц в пулах протеасом в асцитной карциноме в сравнении с протеасомами здоровых органов. Логично предположить, что в случае частичного или полного исключения иммунных субъединиц из состава протеасом клетка могла бы потерять способность продуцировать антигенные эпитопы в достаточном количестве и, избегая контакта с цитотоксическими Т-лимфоцитами, накапливать необходимый «комплект» мутаций и, в конечном итоге, давать начало злокачественной опухоли.

Действительно, с помощью иммуноблоттинга (рис. 6) нами показано, что в асцитной карциноме Krebs-II уровень иммунной субъединицы LMP7 (рис. 6 в) в 12 раз ниже, чем в контрольных клетках легких, и в 4-5 раз ниже, чем в селезенке и печени, из расчета на мг белка осветленных гомогенатов. Иммунная субъединица LMP2 (рис. 6 г) в клетках асцитной карциномы, в отличие от легких, селезенки и печени, практически не выявлялась.

Нужно отметить, что в многочисленных клеточных линиях злокачественных опухолей грызунов и человека с помощью RT PCR-анализа исследованы уровни мРНК полипептидов, участвующих в образовании и представлении антигенных эпитопов клеткам иммунной системы (Maeurer et al., 1996; Johnsen et al., 1998; Delp et al., 2000; Seliger et al., 2000; Matsui et al., 2002; Miyagi et al., 2003; Krishnakumar et al., 2004). В ряде клеточных линий опухолей различного гистогенеза выявлены низкие уровни мРНК (или мРНК не выявлена совсем) иммунных субъединиц протеасом и белков транспортеров ТАР1 и ТАР2, которые повышались после обработки клеток ИФ. При этом в качестве внутреннего контроля использовалась мРНК -актина. Однако авторы этих исследований сами

Pages:     | 1 || 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»