WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 |

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ им. Н.К. КОЛЬЦОВА

на правах рукописи

УДК 577.152.34+57.083.3



АСТАХОВА Татьяна Михайловна
ИЗМЕНЕНИЕ ПУЛА ПРОТЕАСОМ
В ПОСТНАТАЛЬНОМ РАЗВИТИИ И
В ЗЛОКАЧЕСТВЕННО ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ КЛЕТКАХ ГРЫЗУНОВ

03.00.30 биология развития и эмбриология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва, 2007

Работа выполнена в лаборатории биохимии Института биологии развития

им. Н.К. Кольцова Российской академии наук

Директор Института:

доктор биологических наук, профессор

Озернюк Николай Дмитриевич

Научный руководитель:

доктор биологических наук

Шарова Наталья Петровна

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор

Немова Нина Николаевна

доктор биологических наук, профессор

Захарова Людмила Алексеевна

Ведущая организация:

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, Москва

Защита диссертации состоится «____» ____________ 2007 г. в ______ ч.

на заседании Диссертационного совета Д 002.238.01

при Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, д. 26.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (Москва, ул. Вавилова, д. 26)

Факс: (495) 135-80-12

E.mail: volina46@bk.ru

Автореферат разослан «____» ____________ 2007 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат биологических наук Е.В.Волина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Протеасомы – это мультисубъединичные и мультикаталитические протеиназные комплексы эукариотических клеток (Multicatalytic Proteinase Complex, MPC). Термин «протеасома» был предложен К. Танака и А. Голдбергом и отражает как протеолитическую (протеаза) функцию комплекса, так и его природу как дискретной частицы – сомы.

Клетки млекопитающих и человека содержат несколько форм и субтипов протеасом. Наиболее изученными формами являются 26S- и 20S-протеасомы. 26S-протеасомы состоят из 20S-субчастицы – протеолитического «ядра» – и фланкирующих ее 19S-субчастиц. Они гидролизуют убиквитинированные белки в АТФ-зависимой реакции. 20S-протеасомы, помимо того, что являются протеолитическим «ядром» 26S-протеасом, способны, как самостоятельные частицы, гидролизовать некоторые белки без их предварительного убиквитинирования независимо от АТФ. Каждая из этих форм образована четырьмя субтипами, различающимися сочетанием конститутивных и иммунных протеолитических субъединиц.

Конститутивные 26S-протеасомы участвуют в регуляции клеточных процессов, таких как репликация и репарация ДНК, транскрипция, передача сигналов, клеточный цикл, апоптоз, поскольку гидролизуют белки, осуществляющие эти процессы, строго контролируемым способом. Иммунные 26S-протеасомы необходимы для развития иммунного ответа. Функции всех субтипов 20S-протеасом связаны, главным образом, с уничтожением поврежденных белков.

Принимая во внимание неоднозначную роль протеасом в многочисленных клеточных процессах, можно ожидать, что на разных этапах онтогенеза животных функции клеточного пула протеасом меняются, причем по-разному в различных органах и тканях. Литературные данные об изменениях пула протеасом в индивидуальном развитии животных малочисленны и разрозненны. Совсем нет сведений о функционировании протеасом в постнатальном развитии млекопитающих, сопряженном с интенсивными биохимическими и физиологическими перестройками организма. Исследования в этой области могут расширить представление о молекулярных механизмах онтогенеза и содействовать пониманию причин как врожденных, так и приобретенных заболеваний (в том числе злокачественных), связанных с нарушениями системы гидролиза белков в протеасомах.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось исследование изменения пула 26S- и пула 20S-протеасом в печени (нелимфоидном органе) и селезенке (лимфоидном органе) крысы в постнатальном развитии и в клетках асцитной карциномы Krebs-II мыши.

Для достижения поставленной цели требовалось решить следующие задачи:

  1. Разработать метод разделения пулов 26S- и 20S-протеасом для их сравнительного анализа в различных органах.
  2. Изучить активность химотрипсинподобных центров и относительное количество протеасом в пулах 26S и 20S в селезенке и печени крысы в постнатальном развитии.
  3. Исследовать динамику появления иммунных субъединиц LMP7 и LMP2 в пулах 26S- и 20S-протеасом в селезенке и печени крысы.

4. Изучить динамику формирования периартериальных лимфоидных оболочек (муфт) белой пульпы селезенки крысы.

5. Сравнить активность, состав и относительное количество протеасом в пулах 26S и 20S в клетках асцитной карциномы Krebs-II мыши с таковыми в клетках легких здоровых животных.

Научная новизна. В работе впервые продемонстрирована возможность аналитического изучения нативных пулов 26S- и 20S-протеасом в различных органах млекопитающих, проведено детальное исследование этих пулов в первые три недели постнатального развития в печени и селезенке крысы и прослежена динамика формирования в этих органах иммунных протеасом, выявлены особенности пула 26S-протеасом в опухоли.

Научная и практическая значимость работы. Полученные результаты свидетельствуют о появлении иммунных протеасом в лимфоидных (селезенке) и нелимфоидных органах (печени) в разные сроки в течение нескольких недель после рождения и отвечают на существующий до сих пор вопрос иммунологов, почему в эмбриональном и раннем постнатальном развитии млекопитающих при наличии Т- и В-лимфоцитов нет полноценного иммунного ответа. Не менее важным в понимании развития иммунной системы млекопитающих является и установленный нами факт, что формирование четких периартериальных лимфоидных оболочек белой пульпы селезенки совпадает в сроках постнатального развития с появлением иммунных протеасом в печени. Он позволяет понять механизм складывающихся в организме взаимоотношений лимфоидных и находящихся под их защитой нелимфоидных органов. Полученные результаты раскрывают новые перспективы в изучении развития иммунной системы в онтогенезе млекопитающих, которое следует рассматривать не только как созревание и миграцию клеток иммунной системы, но и как образование иммунных протеасом во всем организме.

Проведенная нами работа по изучению особенностей пулов 26S- и 20S-протеасом в клетках асцитной карциномы Krebs-II мыши дала результаты, которые представляют ценность для фундаментальной науки и со временем могут найти применение в практической медицине.

Апробация работы. Материалы диссертации апробированы на коллоквиумах лаборатории биохимии Института биологии развития им. Н.К.Кольцова РАН; Школе для молодых ученых, Научная биологическая станция Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН «Кропотово», июнь 2005 г.; 15-ом Международном конгрессе биологов развития, Австралия, сентябрь 2005 г.; конференции «Молекулярные механизмы процессов онтогенеза: эмбриогенез, геномы, эволюция», Москва, май 2006 г.; VI симпозиуме «Химия протеолитических ферментов», Москва, апрель 2007 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано четыре статьи и двое тезисов, одна статья и одни тезисы находятся в печати.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования, их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 107 страницах и содержит 22 иллюстрации. Список литературы включает 128 цитируемых источника.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АПК – антигенпредставляющие клетки

АТФ – аденозинтрифосфорная кислота

ГКГ – главный комплекс гистосовместимости

ИФ – -интерферон

ОДК – орнитиндекарбоксилаза

ПААГ – полиакриламидный гель

Ds-Na – додецилсульфат натрия

ECL – Enhanced Hemiluminescence

LMP2, LMP7, LMP10 – low-molecular-weight protein 2 (7, 10)

MPC – Multicatalytic Proteinase Complex

Rpt 6 – Regulatory Particle Triple-A protein 6

Suc-LLVY-AMC – N-succinyl-leu-leu-val-tyr7-amido-4-methyl coumarin

TAP – Transporter Associated with Antigen Presentation

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Протеасомы выделяли из печени (нелимфоидный орган) и селезенки (лимфоидный орган) белых крыс породы Wistar разных возрастов постнатального развития, печени, селезенки и легких здоровых мышей линии Balb/c и развившейся семидневной асцитной карциномы Krebs-II, привитой мышам линии Balb/c.

Пулы 26S- и 20S-протеасом разделяли методом двухэтапного фракционирования осветленных гомогенатов органов разным количеством сульфата аммония (Ben-Shahar et al., 1999). Идентификацию 26S- и 20S-протеасом проводили с помощью гель-фильтрации на сефарозе 2В, анализа активности в присутствии 0,02% Ds-Na и по способности гидролизовать 35[S]ОДК.

Активность протеасом определяли по гидролизу флуорогенного олигопептида Suc-LLVY-AMC (Ben-Shahar et al., 1999). Образовавшийся продукт регистрировали на флуориметре при значениях возбуждающей длины волны 380 нм и эмиссии 440 нм. За единицу активности протеасом принимали количество фермента, при котором гидролизуется 1 нмоль Suc-LLVY-AMC в течение 1 мин.

35[S]ОДК синтезировали в бесклеточной системе лизата ретикулоцитов кролика. В качестве матрицы для синтеза 35[S]ОДК использовали плазмиду pCITE со вставкой гена ОДК, связанного на С-конце с последовательностью, кодирующей шесть остатков гистидина. Гидролиз 35[S]ОДК (3500 имп/мин) проводили в присутствии протеасом (300 ед.) и антизима (0,2 мкг). Пробы анализировали электрофорезом в 13%-ном ПААГ в присутствии Ds-Na по методу Лэммли (Laemmli, 1970).

Относительное количество протеасом определяли Вестерн-блоттингом с использованием антител к -субъединицам, формирующим 20S-субчастицы, и к субъединице Rpt6, входящей в состав 19S-субчастицы 26S-протеасом.

Иммунные субъединицы выявляли Вестерн-блоттингом с использованием антител к субъединицам LMP2 и LMP7.

Плотность полос, выявленных на рентгеновской пленке реакцией хемилюминесценции с использованием системы ECL, оценивали с помощью стандартной компьютерной программы «Image J».

Гистологические срезы селезенки окрашивали гематоксилин-эозином и заключали в бальзам. Микроскопическое исследование полученных срезов проводили с помощью светового микроскопа Olympus AHBT3 (Австрия).

Концентрацию белка определяли по методу Лоури (Lowry et al., 1951), а также с помощью увикорда (LKB Bromma, Швеция) по поглощению при длине волны 280 нм.

Результаты исследования и их обсуждение

Разработка метода разделения пулов 26S- и 20S-протеасом.

Классификации множественных форм протеасом до сих пор нет. Это затрудняет понимание физиологической роли тотального пула протеасом в различных органах, так как соотношение форм и субтипов протеасом ткане- и органоспецифично. Поэтому мы предлагаем разделить все многообразие протеасом на два основных пула – 26S и 20S, учитывая их главные структурные и функциональные различия. При разработке метода разделения пулов 26S- и 20S-протеасом мы исходили из известного факта, что формы 26S и 20S осаждаются при разном количестве сульфата аммония. При 0–40% от насыщения осаждаются, преимущественно, 26S-протеасомы, при 40–70% – 20S-протеасомы (Ganoth et al., 1988; Eytan et al., 1989; Ben-Shahar et al., 1999). После фракционирования сульфатом аммония исследователи обычно проводили дальнейшую очистку как пула 26S-, так и пула 20S-протеасом различными методами. В процессе этой очистки 26S-протеасомы в большей или меньшей степени разрушались. Поэтому нам представлялось логичным изучить возможность применения фракционирования препаратов сульфатом аммония в качестве единственного этапа разделения пулов протеасом для решения последующих задач.

Идентификацию 26S- и 20S-протеасом в полученных фракциях проводили с помощью гель-фильтрации на сефарозе 2В, анализа активности в присутствии 0,02% Ds-Na и по способности гидролизовать 35[S]ОДК. С помощью гель-фильтрации на сефарозе 2В показано, что фракция 0–40% (фракция 1) содержит протеасомы с М.м. более 2000 кДа, а фракция 40–70% (фракция 2) – протеасомы с М.м. около 900 кДа, что соответствует, по литературным данным, М.м. 26S- и 20S-протеасом (Coux et al., 1996). Известно, что 0,02% Ds-Na ингибирует активность 26S-протеасом, но активирует 20S-протеасомы (Dahlmann et al., 1993; Kisselev et al., 1998). Во фракции 1 было зафиксировано ингибирование активности в присутствии 0,02% Ds-Na на 56%, во фракции 2 активность повышалась на 260%. Таким образом, было доказано, что фракция 2 свободна от примеси 26S-протеасом и, следовательно, пригодна для изучения пула 20S-протеасом.

Реакция гидролиза ОДК была использована для уточнения форм протеасом во фракции 1. Способность гидролизовать ОДК без предварительного убиквитинирования в присутствии антизима характерна только для 26S-, но не 20S-протеасом (Murakami et al., 1992). 35[S]ОДК синтезировали в бесклеточной системе лизата ретикулоцитов кролика. В качестве матрицы использовали плазмидный ДНК-вектор со вставкой гена ОДК. Уменьшение уровня ОДК наблюдали в присутствии фракции 1, но не фракции 2. Эти результаты подтвердили, что фракция 1 содержит нативный пул 26S-протеасом и может быть использована для аналитических исследований в дальнейшей работе.

Особенности формирования пулов 26S- и 20S-протеасом в селезенке и печени крысы в постнатальном развитии.

Pages:     || 2 | 3 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»