WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

По три мутации четырех наиболее интересных генов, входящих в Ddc-кластер, были использованы для постановки количественных комплементационных тестов, позволяющих понять, участвуют ли эти гены в контроле продолжительности жизни. В число исследуемых генов вошли Catecholamines up (Catsup, регулирует активность тирозингидроксилазы, катализирующей первую реакцию в цепи биосинтеза катехоламинов, превращение тирозина в дофа), Dopa decarboxylase (Ddc, кодирует дофадекарбоксилазу, катализирующую вторую реакцию в цепи биосинтеза катехоламинов, превращение дофа в дофамин, основной катехоламин, участвующий в передаче нервного импульса), Diphenol oxidase A2 (Dox-A2, кодирует фенолоксидазу, катализирующую превращение дофамина в дофа хинон, необходимый для образования пигмента) и alpha metil dopa-resistant (amd, катализирует превращение дофамина в некоторые производные, необходимые для отвердевания кутикулы).

Суммарный анализ трех мутаций гена Catsup продемонстрировал их некомплементарность аллелям этого гена в линиях 2b и Oregon у самцов. Анализ, проведенный для разных мутаций отдельно, подтвердил их некомплементарность. При этом достоверных различий между влиянием разных мутаций на продолжительность жизни выявлено не было. У самок во всех случаях достоверных эффектов не наблюдалось. Полученные результаты указывают на то, что ген Catsup играет роль в контроле продолжительности жизни самцов дрозофилы, а его аллели в линиях 2b и Oregon различны.

Суммарный анализ трех мутаций гена Dox-A2 продемонстрировал их некомплементарность аллелям этого гена в линиях 2b и Oregon у самцов. Анализ, проведенный для разных мутаций отдельно, подтвердил их некомплементарность. И в этом случае формально мутации не отличались между собой. У самок во всех случаях достоверных эффектов не наблюдалось. Полученные результаты свидетельствуют о том, что ген Dox-A2 играет роль в контроле продолжительности жизни у самцов дрозофилы, а аллели его в линиях 2b и Oregon различны.

Суммарный анализ трех мутаций гена Ddc продемонстрировал их некомплементарность аллелям этого гена в линиях 2b и Oregon и у самцов, и у самок. Однако при этом достоверные различия между влиянием разных мутаций на продолжительность жизни были выявлены как у самцов, так и у самок. Анализ, проведенный для разных мутаций отдельно, подтвердил некомплементарность мутаций Ddc27 и Ddclo1 у самцов и мутации Ddc43 у самок. Полученные результаты указывают на то, что ген Ddc играет роль в контроле продолжительности жизни дрозофилы, а его аллели в линиях 2b и Oregon различны, причем действие Ddc на продолжительность жизни зависит от аллеля гена и пола особей.

Все три мутации гена amd, проанализированных как вместе, так и по отдельности, продемонстрировали комплементарность аллелям этого гена в линиях 2b и Oregon и у самцов, и у самок. Следовательно, ген amd не связан с контролем продолжительности жизни в исследуемых нами линиях.

Исследование молекулярного полиморфизма двух из выявленных нами генов, Ddc и Catsup, в природной популяции мух Raleigh, проведенное в Государственном университете Северной Каролины, подтвердило, что эти два гена определяют изменчивость продолжительности жизни, по крайней мере, в этой популяции (De Luca et al., 2003; Carbone et al., 2006). Примечательно то, что один из значимых полиморфизмов в гене Ddc затрагивает экзон, характерный для фермента, функционирующего исключительно в нервной системе.

Мы обратили внимание, что в цитологическом районах 7А6;7B2, выяленном в данной работе, и в цитологическом районе 64C;65C, выявленном с помощью делеционного картирования ранее, расположены гены inactive (iav) и pale (ple), соответственно. Эти гены влияют на уровень катехоламинов у дрозофилы. Единственная найденная в коллекционных центрах культур дрозофилы мутация каждого из этих генов была использована для постановки теста на комплементацию. Полученные результаты мутационного картирования свидетельствуют о комплементарности мутаций генов iav и ple аллелям соответствующих генов в линиях 2b и Oregon. Следовательно, гены iav и ple не связаны с контролем продолжительности жизни в исследуемых нами линиях. Можно предположить, что в районах 7A6;B2 и 64C;65C локализуются другие контролирующие продолжительность жизни гены, аллели которых различны в линиях 2b и Oregon.

В итоге проведенной работы мы описали две группы генов-кандидатов, связанных с ранее неизвестными путями контроля продолжительности жизни. Первая группа представлена генами, участвующими в биосинтезе катехоламинов и передаче нервного импульса в нейронах (Catsup, Ddc, Dox-A2), вторую группу составляют гены, кодирующие транскрипционные факторы РНК-полимеразы II, которые участвуют в контроле развития и функционирования нервной системы, в частности, мотонейронов (stc, tup, Lim3).

Доказательство участия генов stc, crol и esg в контроле продолжительности жизни

Эксперименты по картированию позволили нам выявить гены, которые предположительно играют роль в контроле продолжительности жизни дрозофилы, так называемые гены-кандидаты. Доказательство реальной вовлеченности выявленных нами генов-кандидатов в контроль продолжительности жизни представляет собой важную самостоятельную задачу, имеющую существенное значение для пополнения наших знаний о молекулярно-генетических основах изменчивости такого важного признака как продолжительность жизни.

Один из способов прямого доказательства участия какого-либо гена в контроле какого-либо признака заключается в исследовании влияния на этот признак инсерционных мутаций данного гена, вызванных встройкой в него специальных векторных конструкций, и их реверсий. Считается, что если инсерция приводит к изменению изучаемого признака, а чистое вырезание вектора к реверсии по этому признаку, то ген участвует в контроле данного признака. Главное преимущество этого подхода заключается в том, что выводы о влиянии на признак изменений в каком-либо гене основываются на сравнении линий, отличающихся только аллельным состоянием данного гена при полной идентичности генетического окружения.

Большинство векторных конструкций имеют в своем составе маркерный ген – нормальный аллель гена white (w). Исходная линия без инсерций содержит мутацию этого гена, приводящую к белоглазости, встройка векторной конструкции детектируется по изменению цвета глаз на красный. Особенностью векторных конструкций является то, что встройка их в геном остается стабильной. Однако использование стандартных скрещиваний позволяет мобилизовать векторную конструкцию и вырезать ее из места встройки, что фенотипически может быть детектировано по восстановлению белоглазости и формально должно привести к реверсии инсерционной мутации. Известно, однако, что вырезание может произойти неточно, так что часть гена окажется делетированной или же, наоборот, в месте встройки сохраниться часть конструкции, не содержащая маркерный ген. В принципе возможна также встройка части конструкция в какой-либо другой район генома.

Мы начали работу с гена stc. Из коллекционного центра культур дрозофилы в Блумингтоне (США) были выписаны две линии: исходная контрольная линия и линия с инсерцией векторной конструкции P{SUPor-P} в 5’-нетранслируемую область гена stc. Мухи, несущие эту инсерционную мутацию в гомозиготном состояний, были жизнеспособны, что является необходимым условием использования мутации в опытах, доказывающих участие гена в контроле продолжительности жизни. Из этой линии, используя стандартные скрещивания, позволяющие мобилизовать векторную конструкцию, мы получили 5 линий с реверсией маркерного фенотипа. Данные молекулярного анализа этих линий, полученные А. В. Симоненко и Е. В. Ершовой, свидетельствуют о том, что во всех 5 линиях произошло точное вырезание векторной конструкции из сайта встройки.

В контрольной и мутантной линиях, а также в линиях с реверсиями, мы измерили продолжительность жизни 300 девственных самцов и 300 девственных самок. Отбор мух и измерение продолжительности жизни проводили так же, как в опытах по делеционному и мутационному картированию. Для сравнения средних значений продолжительности жизни использовали критерий Стьюдента. Было показано, что инсерция вектора не влияет на продолжительность жизни самцов, но приводит к достоверному увеличению средней продолжительности жизни самок (рисунок 2). Поскольку в результате инсерции фенотип менялся только у самок, результат реверсии тоже можно было обнаружить только у самок. Во всех линиях с чистым вырезанием вектора средняя продолжительность жизни самок достоверно отличалась от средней продолжительности жизни самок мутантной линии и не отличалась от контроля (рисунок 2). Этот вывод подтверждает и анализ выживания самок (рисунок 3). На рисунке 3А приведены кривые выживания контрольных и мутантных самок с указанием стандартных ошибок (GraphPad Prism 4, GraphPad Software, San Diego, California, USA), масштаб которых характерен для всех полученных в работе кривых выживания. В связи с этим во всех остальных случаях кривые выживания будут приведены без указания ошибок, чтобы не загромождать рисунки. Кривая выживания мутантных самок достоверно отличается как от кривой выживания контрольных самок (P<0,0001; тест Каплана-Мейера), так и от кривых выживания самок-ревертантов (P<0,0001 во всех случаях), в то время как различия между контрольными самками и самками-ревертантами недостоверны (P=0.4784; P=0.7472; P=0.6234; P=0.5789; P=0.7496).

Рисунок 2. Средняя продолжительность жизни девственных самок контрольной линии, линии w1118; stcKG01230 и линий с реверсиями.

А

Б

Рисунок 3. Кривые выживания девственных самок контрольной линии, линии w1118; stcKG01230 и линий с реверсиями. А. Сравнение контрольной и мутантной линии. Б. Сравнение контрольной и мутантной линий с ревертантами.

В результате мобилизации векторных конструкций довольно редко удается добиться чистого их вырезания. Как правило, для доказательства участия гена в контроле признака приходится ограничиваться анализом одного истинного ревертанта. Получение пяти истинных реверсий мутации stcKG01230 является большой редкостью, и это позволило нам проанализировать связь между состоянием гена и характером признака в пяти независимых случаях. По признаку «средняя продолжительность жизни самок» реверсия мутации на молекулярном уровне в пяти независимых случаях сопровождалась реверсией фенотипа. Проведенный дополнительно анализ продолжительности жизни скрещивавшихся самок контрольной и мутантной линий, а также линий с реверсиями в целом подтвердил полученные выводы. Направление эффекта мутации stcKG01230 в данном случае оказалось противоположным: продолжительность жизни самок в линии с мутацией была ниже продолжительности жизни самок в контрольной линии и в линиях с реверсиями. В одной линии с реверсией продолжительность жизни скрещивавшихся самок не вернулась к контрольному уровню. Причины этого непонятны и заслуживают дальнейшего исследования. В целом, несмотря на это исключение, мы считаем, что причинно-следственная связь между изменениями молекулярной структуры гена stc и изменениями продолжительности жизни хорошо доказана. Таким образом, ген stc действительно участвует в контроле продолжительности жизни.

Наши коллеги из Государственного университета Северной Каролины проводили поиск линий, в которых встройка различных векторных конструкций на основе P-элемента в случайные районы генома привела к увеличению продолжительности жизни мух. В одной из найденных линий встройка векторной конструкции на расстоянии 100 пар оснований от начала структурной части гена crooked legs (crol) привела к увеличению средней продолжительности жизни самцов. В другой линии встройка на расстоянии 600 пар нуклеотидов от конца структурной части гена escargot (esg) также привела к увеличению средней продолжительности жизни самцов. И в том, и в другом случае мухи, несущие эту инсерционную мутацию в гомозиготном состояний, были жизнеспособны.

Ген crol кодирует транскрипционный фактор РНК полимеразы II, экспрессия которого в центральной нервной системе, ножных имагинальных дисках и слюнных железах индуцируется экдизоном (D’Avino, Thummel, 1998). В настоящее время остается, правда, неясным, какую именно роль этот ген играет в развитии и функционировании нервной системы. Ген esg кодирует транскрипционный фактор РНК полимеразы II, который принимает участие в регуляции асимметричных делений нейробластов во время развития нервной системы, клеточной спецификации и формирования поведенческих реакций (Cai et al., 2001; Yagi et al., 1998). Таким образом, эти два гена так же, как гены stc, tup и Lim3 кодируют транскрипционные факторы, участвующие в регуляции развития и функционирования нервной системы. Мы решили исследовать эти гены более подробно и доказать их участие в контроле продолжительности жизни дрозофилы.

Поскольку первичная характеристика продолжительности жизни в контрольных линиях и в линиях с инсерцией векторной конструкции в районы генов crol и esg были известны, мы начали работу с получения линий-ревертантов. Из линии с инсерцией векторной конструкции в район гена crol мы получили три линии с реверсией маркерного фенотипа, а из линии с инсерцией векторной конструкции в район гена esg – семь линий. Данные, полученные А.В. Симоненко, свидетельствуют о том, что для каждого из этих генов только в одной линии произошло точное вырезание векторной конструкции из места встройки.

Мы измерили продолжительность жизни 200 девственных самцов и 200 девственных самок контрольных линий и линий с инсерцией в районы генов crol и esg. Отбор мух и измерение продолжительности жизни проводили так же, как в опытах по делеционному и мутационному картированию. Было показано, что инсерция векторной конструкции в районы генов crol и esg не повлияла на среднюю продолжительность жизни самок, но привела к достоверному увеличению средней продолжительности жизни самцов. Поскольку продолжительность жизни контрольных самок и самок с инсерционной мутацией не отличалась, эффект реверсии у мух этого пола наблюдать было невозможно. Чтобы оценить фенотипический эффект реверсии, мы сравнили продолжительность жизни 200 самцов контрольных, мутантных линии и самцов каждой из линий-ревертантов, в которых произошло чистое вырезание вектора (рисунок 4).

Рисунок 4. Средняя продолжительность жизни самцов контрольной линии, линий с инсерциями P{GT1} в районы генов esg и crol и линий-ревертантов с чистым вырезанием.

А

Pages:     | 1 | 2 || 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»