WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 || 3 | 4 |

Мы использовали 10 делеций, перекрывающих район 36В;38В, еще 3 делеции этого района были исследованы ранее (рисунок 1). Делеции Df(2L)Sd37 и Df(2L)TW9 оказались комплементарными аллелям искомых генов в линиях 2b и Oregon, таким образом, левая точка разрыва делеции Df(2L)Sd37 определила правую границу значимого района, 37D2. Левую границу значимого района в подсекции 36E4 определила левая точка разрыва Df(2L)TW50, для которой ранее также была выявлена комплементарность. Таким образом, значимый район находится между 36E4 и 37D2. Правая точка разрыва Df(2L)TW137 находится в 37В9-С1, а левая точка разрыва Df(2L)VA17 находится в 37С1-4, то есть эти делеции, возможно, не перекрываются. Таким образом, по крайней мере один район локализации генов, участвующих в контроле продолжительности жизни, находится между 36Е4 и 37C1, и по крайней мере еще один – между 37С1 и 37D2.

В целом картина комплементации оказалась сложной. Учитывая характер перекрывания делеций, наличие или отсутствие комплементации, а также то, что часть делеций имеет эффекты у самцов, часть – у самок, а часть – и у самцов, и у самок, мы предполагаем, в качестве наиболее общей гипотезы, что гены, участвующие в контроле продолжительности жизни и отвечающие за изменчивость по этому признаку, локализуются в районах 36Е4;37C1 и 37С1;37D2, причем для объяснения всех полученных результатов необходимо допустить, что в каждом районе существуют два или более генов, связанных с изучаемым признаком.

Мы использовали 15 делеций, перекрывающих район 6Е;10D (рисунок 1). Только одна делеция Df(1)Sxl-ra, перекрывающая участок хромосомы 6F5;7B3 по цитологической карте политенных хромосом продемонстрировала некомплементарность. Эта делеция перекрывается с двумя соседними комплементарными делециями, которые ограничивают значимый район в сайте 7А6 с дистальной стороны и в сайте 7B2 с проксимальной. Таким образом, локализация генов, предположительно участвующих в контроле продолжительности жизни и отвечающих за изменчивость по этому признаку, была уточнена до цитологического района 7А6;7B2.

Рисунок 1. Делеционное картирование генов, контролирующих продолжительность жизни. Показаны политенные хромосомы: Х и II (плечо 2L), арабскими цифрами обозначены секции хромосом, пунктирными рамками показаны районы генома, выявленные ранее с помощью рекомбинационного картирования. Делеции показаны горизонтальными линиями; значимые делеции – толстыми горизонтальными линиями. В красные рамки заключены делеции, использовавшиеся в данной работе. Серым цветом обозначены выявленные ранее и в данной работе районы генома, содержащие гены-кандидаты, участвующие в контроле продолжительность жизни. (1) Df(1)Sxl-bt/FM7c; (2) Df(1)Sxl-ra/FM7c; (3) Df(1)ct4 b1/FM7c; (4) Df(1)C128/FM7c; (5) Df(1)RA2/FM7c; (6) Df(1)KA14/FM7c; (7) Df(1)lz-90b24/FM7c; (8) Df(1)9a4-5/FM7c; (9) Df(1)C52/FM7c; (10) Df(1)v-L15/FM7c; (11) Df(1)vN124B/FM7c; (12) Df(1)v-L2/FM7c; (13) Df(1)RA37/FM7c; (14) Df(1)GA112/FM7c; (15) Df(1)HA85/FM7c; (16) Df(2L)Prl/CyO; (17) Df(2L)fn30/CyO; (18) Df(2L)64j/CyO; (19) Df(2L)fn7/CyO; (20) Df(2L)A376/CyO; (21) Df(2L)A263/CyO; (22) Df(2L)A217/In(2LR)Gla; (23) Df(2L)fn5/CyO; (24) Df(2L)fn1/CyO; (25) Df(2L)A245/CyO; (26) Df(2L)TE35BC-8/CyO; (27) Df(2L)osp29/CyO; (28) Df(2L)TE35BC-34/CyO; (29) Df(2L)TE35BC-24/CyO; (30) Df(2L)TE35BC-3/CyO; (31) Df(2L)TW137/CyO; (32) Df(2L)VA18/CyO; (33) Df(2L)TW50/CyO; (34) Df(2L)TW158/CyO; (35) Df(2L)pr-A16/CyO; (36) Df(2L)VA23/CyO; (37) Df(2L)TW130/CyO; (38) Df(2L)VA17/CyO; (39) Df(2L)VA12/CyO; (40) Df(2L)VA19/CyO; (41) Df(2L)Sd77/CyO; (42) Df(2L)Sd37/SM5; (43) Df(2L)TW9/CyO; (44) Df(2L)TW161/CyO; (45) Df(2L)DS6/CyO.

Всего, с учетом ранее полученных результатов, было выявлено по крайней мере 14 районов хромосом, в которых локализуются гены, участвующие в контроле продолжительности жизни и отвечающие за изменчивость по этому признаку. Размер выявленных районов и количество локализованных в них генов довольно сильно варьировали.

В секции 35 политенных хромосом ранее было выявлено два района локализации генов, предположительно участвующих в контроле продолжительности жизни, 35B9;35C3 и 35D5;35E1. Их суммарный размер составляет около 418 тысяч пар оснований, однако количество известных и предсказанных генов невелико (31), причем только для четырех генов в коллекционных центрах культур дрозофилы можно было найти линии с мутациями, которые необходимы для количественных комплементационных тестов. Было решено довести исследование районов 35B9;35C3 и 35D5;35E1 до конца и протестировать все доступные для анализа мутации расположенных в них генов: shuttle craft (stc), кодирует транскрипционный фактор РНК-полимеразы II, четыре мутации; reduced (rd), функция неизвестна, одна мутация; guftagu (gft), кодирует белок, связывающий убиквитин-протеин лигазу, одна мутация; male sterile (2)35Ci (ms(2)35Ci), функция неизвестна, одна мутация.

Мутации генов rd и gft оказались комплементарными аллелям этих генов в линиях 2b и Oregon как у самцов, так и у самок. Следовательно, гены rd и gft не связаны с контролем продолжительности жизни в исследуемых нами линиях.

Мутации в гене ms(2)35Ci оказалась некомплементарной аллелям этого гена в линиях 2b и Oregon у самцов, но не у самок. Полученные результаты указывают на то, что ген ms(2)35Ci играет роль в контроле продолжительности жизни у самцов дрозофилы, а его аллели в линиях 2b и Oregon различны.

Суммарный анализ четырех мутаций гена stc выявил достоверные различия между влиянием разных мутаций на продолжительность жизни как самцов, так и самок. В связи с этим целесообразно было провести анализ эффектов каждой мутации по отдельности. Оказалось, что две мутации, stc6 и stck11112, некомплементарны аллелям этого гена в линиях 2b и Oregon у самок. Две другие мутации, stc3 и stc05441, оказались комплементарными. Полученные результаты указывают на то, что ген stc играет роль в контроле продолжительности жизни у самок дрозофилы, а его аллели в линиях 2b и Oregon различны, однако действие stc на продолжительность жизни является аллель-специфическим. Отметим, что исходя из ранее проведенного делеционного картирования, мы ожидали, что в районе 35B9;35C3 находятся гены, влияние которых на продолжительность жизни проявляется именно у самок.

Ген stc показался нам весьма интересным и перспективным для дальнейшего исследования. Отметим, что в проведенных опытах генетическое окружение исследованных мутаций было случайным. Очевидно, что эпистатические взаимодействия генов могут существенно влиять на изучаемые эффекты, поскольку продолжительность жизни представляет собой сложный признак, определяемый многими генами. Статистический анализ количественного теста на комплементацию таков, что позволяет учесть эффекты генетического окружения. Тем не менее, чтобы подтвердить участие гена stc в контроле продолжительности жизни, мы решили экспериментально оценить вклад генетического окружения в получаемые в комплементационном тесте результаты. Для этого тесты провели в разном генетическом окружении: в первом, уже описанном случае генетический фон был случайным; во втором случае вторая хромосома с мутацией stc находилась в окружении первой и третьей хромосомы изогенной линии дикого типа Samarkand (Sam; mut/Bal; Sam, линии были получены из лаборатории Труди Маккей, Государственный университет Северной Каролины, США). Для этого опыта были также использованы специально полученные в Государственном университете Северной Каролины линии, в которых вторая хромосома линий Oregon и 2b находилась в окружении первой и третьей хромосомы линии Samarkand (Sam; Ore; Sam и Sam; 2b;Sam).

Полученные результаты показали, что действие мутаций stc6, stck11112, stc05441 и stc3 по-разному проявляется в разном генетическом окружении и зависит от характера мутаций.

В случайном генетическом окружении эффект мутации stc6 был специфичен для самок, при этом 2b/stc6 самки жили дольше, чем Ore/stc6 самки. В гомозиготном Sam окружении мутация stc6 также продемонстрировала некомплементарность у самок, однако продолжительность жизни Ore/stc6 самок была больше, чем продолжительность жизни 2b/stc6 самок. В целом некомплементарность данной мутации аллелям гена stc в линиях Oregon и 2b была подтверждена результатами тестов в различном генетическом окружении. Влияния stc6 на продолжительность жизни самцов не было обнаружено ни в одном из вариантов теста. В целом полученные данные согласуются с выводом о специфичном для самок влиянии stc6 на продолжительность жизни, сила и направление которого зависят от генетического фона.

Специфичный для самок эффект мутации stck11112, наблюдавшийся в случайном генетическом окружении, не удалось статистически значимо воспроизвести в гомозиготном Sam окружении, так как размеры выборки как для Ore/Bal и 2b/Bal генотипов были сильно уменьшены в этом эксперименте, что привело к значительным потерям в силе статистического анализа. Следует заметить, однако, что разница в средней продолжительности жизни между Ore/stck11112 и 2b/stck11112 самками была очень большой (30 дней) и достоверной. В случайном генетическом окружении продолжительность жизни самок Ore/stck11112 была больше, чем продолжительность жизни самок 2b/stck11112, в гомозиготном Sam окружении направление эффекта было противоположным. Влияния stck11112 на продолжительность жизни самцов не было обнаружено ни в одном из вариантов теста. В целом полученные данные согласуются с выводом о специфичном для самок влиянии stck11112 на продолжительность жизни, сила и направление которого зависят от генетического фона.

Значимый эффект stc3 и stc05441 на продолжительность жизни самок не был выявлен ни в случайном, ни в гомозиготном Sam окружении. Значимого эффекта stc3 и stc05441 не наблюдалось также и у самцов в случайном окружении. Тем не менее, в гомозиготном Sam окружении, то есть выровненном генетическом фоне, обе мутации продемонстрировали некомплементарность аллелям гена stc в линиях 2b и Oregon у самцов. Направление комплементационного эффекта для самцов в гомозиготном Sam окружении было одинаковым для обеих мутаций, при этом продолжительность жизни 2b/stc была больше, чем продолжительность жизни Ore/stc.

Таким образом, проведенные опыты подтвердили, что stc является геном-кандидатом, участвующим в контроле продолжительности жизни, но подчеркнули, что результаты тестов на комплементацию зависят от пола особей, используемого мутантного аллеля и генетического окружения. У дрозофилы stc экспрессируется в эмбрионах, у личинок, куколок и взрослых самцов и самок. Экспрессия в центральной нервной системе эмбрионов необходима для нормального развития мотонейронов и роста аксонов и, как следствие, иннервации мышечных клеток (Stroumbakis et al., 1996).

Согласно современным представлениям нервная система является ключевой тканью в контроле продолжительности жизни. В частности, мотонейроны либо представляют собой клетки, лимитирующие продолжительность жизни целого организма, либо регулируют продолжительность жизни, благодаря системному воздействию на другие клетки и ткани (Parkes et al., 1999). Все вышесказанное делает ген stc интересным геном-кандидатом, участвующим в контроле продолжительности жизни.

В выявленных нами районах 36E4;37C1 и 37С1;37D2 второй хромосомы также локализуются гены, кодирующие транскрипционные факторы РНК-полимеразы II, связанные с развитием и функционированием нервной системы. Для проведения дальнейшего мутационного картирования мы выбрали мутации трех таких генов, tup, Lim3 и Fas3.

Суммарный анализ двух мутаций гена tup у самцов продемонстрировал их некомплементарность аллелям этого гена в линиях 2b и Oregon. Анализ, проведенный для разных мутаций отдельно, подтвердил их некомплементарность. Различия между действием разных мутаций на продолжительность жизни обнаружены не были. У самок во всех случаях достоверных эффектов не наблюдалось. Полученные результаты свидетельствуют о том, что ген tup играет роль в контроле продолжительности жизни у самцов дрозофилы, а аллели его в линиях 2b и Oregon различны.

Суммарный анализ двух мутаций гена Lim3 у самцов продемонстрировал их некомплементарность аллелям этого гена в линиях 2b и Oregon. Анализ, проведенный для разных мутаций отдельно, подтвердил их некомплементарность. Различия между действием разных мутаций на продолжительность жизни обнаружены не были. У самок во всех случаях достоверных эффектов не наблюдалось. Полученные результаты свидетельствуют о том, что ген Lim3 играет роль в контроле продолжительности жизни у самцов дрозофилы, а аллели его в линиях 2b и Oregon различны.

Исследованная мутация гена Fas3 оказалась комплементарной аллелям этого гена в линиях 2b и Oregon как у самцов, так и у самок. Следовательно, ген Fas3 не связан с контролем продолжительности жизни в исследуемых нами линиях.

Гены tup и Lim3 кодируют транскрипционные факторы, вовлечённые в определение идентичности серотониновых и дофаминовых нейронов. Предполагается, что дифференциальная экспрессия этих генов в разных нейронах образует код, определяющий пути их узкой специализации (Thor, Thomas, 1997). Таким образом, наши результаты свидетельствуют о том, что, кроме stc, еще два гена, tup и Lim3, кодирующие транскрипционные факторы РНК-полимеразы II и регулирующие развитие нервной системы, и в частности, мотонейронов, являются кандидатами на участие в контроле продолжительности жизни дрозофилы.

Всего в выявленных в результате делеционного картирования районах находится несколько сотен генов-кандидатов, которые потенциально могут участвовать в контроле продолжительности жизни. Для дальнейшего исследования мы выбрали гены-кандидаты, также связанные с развитием и функционированием нервной системы.

Два выявленных в данной работе района, 36Е4;37C1 и 37C1;37D2, расположены вплотную друг к другу, имеют суммарный размер около 920 тысяч пар оснований и содержат около 120 генов и предсказанных генов, для 43 из которых существуют мутации, необходимые для дальнейших комплементационных тестов. Мы обратили внимание на то, что в этом районе расположен так называемый Ddc-кластер, в котором локализуется около 20 генов, участвующих в биосинтезе катехоламинов. Катехоламины принимают участие в передаче нервного импульса, а также необходимы для правильного отвердевания и окрашивания кутикулы у мух. Они влияют на плодовитость и поведение при скрещивании, циркадные ритмы, эндокринную секрецию, агрессивность, способность к обучению и память (Blenau, Baumann, 2001).

Pages:     | 1 || 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»