WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     || 2 | 3 | 4 |

На правах рукописи

РОЩИНА

Наталья Викторовна

ВЫЯВЛЕНИЕ ГЕНОВ, УЧАСТВУЮЩИХ В КОНТРОЛЕ

ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТИ ЖИЗНИ DROSOPHILA MELANOGASTER

Специальность 03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва

2008 год

Работа выполнена в Лаборатории геномной изменчивости Отдела молекулярной генетики клетки Учреждения Российской академии наук Института молекулярной генетики РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук

ПАСЮКОВА Елена Генриховна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Митрофанов Владимир Григорьевич

доктор биологических наук

АЛЕКСАНДРОВ Игорь Донатович

Ведущая организация: Кафедра генетики Биологического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова.

Защита состоится «___»___________2008 г. в___ часов на заседании диссертационного совета Д 002.238.01 в Учреждении Российской академии наук Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, д. 26.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Автореферат разослан «___»_______________2008 года

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук Абрамова Е.Б.

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Продолжительность жизни является одним из наиболее биологически и социально значимых количественных признаков организма. Ограниченность продолжительности жизни и старение представляют собой универсальные явления. Продолжительность жизни определяется взаимодействием генетических факторов и факторов внешней среды и может сильно отличаться в разных популяциях и у разных особей одного вида. Изучение генетических факторов, лежащих в основе такой вариабельности, представляет большой интерес для понимания причин и условий, обеспечивающих высокую продолжительность жизни.

В настоящее время очевидно, что генетический контроль продолжительности жизни эволюционно консервативен, что делает целесообразным проведение исследований на модельных объектах, в том числе на дрозофиле, большинство генов которой имеет ортологи у других высших эукариот. Локусы, аналогичные выявленным у дрозофилы, могут играть роль в контроле продолжительности жизни и у других организмов, в том числе у человека, и анализ их может пролить свет на общие закономерности контроля продолжительности жизни у многоклеточных.

В течение последних лет достигнут большой прогресс в понимании генетического контроля продолжительности жизни, в частности, благодаря тому, что выявление генов, участвующих в контроле продолжительности жизни, у одного из модельных организмов влекло за собой исследование роли этих и других, взаимодействующих с ними генов у других организмов. Несмотря на очевидные достоинства такого подхода, он ограничивает спектр исследуемых генов. В связи с этим по-прежнему остается актуальным поиск новых генов, не связанных с уже открытыми, но играющих важную роль в контроле продолжительности жизни. Один из возможных подходов заключается в индукции случайных мутаций, другой – в индуцированном изменении экспрессии случайных генов, с последующим тестированием возникающих эффектов. Однако эти методы основаны на выявлении искусственных изменений, часто - повреждений работы генов, приводящих к изменению продолжительности жизни. В Лаборатории геномной изменчивости Учреждения Российской академии наук Института молекулярной генетики РАН разработан и используется метод, основанный на генетическом картировании и позволяющий, во-первых, искать любые новые гены по всему геному, а во-вторых, находить те из них, которые контролируют небольшие различия по исследуемому признаку, лежащие в основе изменчивости продолжительности жизни в естественных условиях (Nuzhdin et al., 1997; Pasyukova et al., 2000). Этот метод был использован и в данной работе, в результате чего начатое ранее картирование удалось довести до выявления отдельных генов и генов-кандидатов, участвующих в контроле продолжительности жизни и определяющих ее изменчивость у Drosophila melanogaster дикого типа.

Цель и задачи работы. Целью работы был поиск новых генов, участвующих в контроле продолжительности жизни Drosophila melanogaster. Работа включала несколько этапов. Прежде всего, необходимо было уточнить границы некоторых из ранее выявленных протяженных районов предполагаемой локализации генов, определяющих различие в продолжительности жизни между двумя линиями дикого типа (Nuzhdin et al., 1997; Vieira et al., 2000; Pasyukova et al., 2000), до небольших участков протяженностью не более нескольких подсекций по карте политенных хромосом. Далее среди генов, локализованных в этих и некоторых других из ранее картированных участков, предполагалось выявить гены-кандидаты, участвующие в контроле продолжительности жизни. Наконец, следовало получить строгое доказательство участия в контроле продолжительности жизни наиболее интересных и перспективных генов-кандидатов. В ходе работы предполагалось также изучить особенности влияния на продолжительность жизни мутаций по этим генам.

В работе были поставлены следующие задачи: 1. Провести тесты на комплементацию с делециями, перекрывающими ранее выявленные протяженные районы хромосом, в которых предположительно локализованы гены, определяющие различие в продолжительности жизни между двумя линиями дикого типа. 2. Провести тесты на комплементацию с мутациями наиболее интересных генов-кандидатов. 3. Подобрать во всемирной коллекции линий дрозофилы линии с мутациями, вызванными встройкой векторных конструкций в район наиболее интересных генов-кандидатов, и получить линии с реверсиями этих мутаций. 4. Охарактеризовать продолжительность жизни в линиях с подобранными инсерционными мутациями и сравнить ее с продолжительностью жизни в исходных линиях без мутаций и в линиях-ревертантах.

Научная новизна работы. Для картирования генов, участвующих в контроле продолжительности жизни, в работе впервые использован метод количественной комплементации с мутациями в генах-кандидатах. Применение этого метода позволило выявить 7 новых генов-кандидатов, участвующих в контроле продолжительности жизни. Роль одного из этих генов, shuttle craft, в контроле продолжительности жизни была доказана в опытах по изучению продолжительности жизни в линии с мутацией, вызванной встройкой векторной конструкции P{SUPor-P} в 5’-нетранслируемую область гена shuttle craft, и в пяти независимо полученных линиях с реверсий этой мутации. Прямые доказательства участия в контроле продолжительности жизни впервые были получены еще для двух генов, escargot и crooked legs. Описаны мутации, приводящие к увеличению продолжительности жизни.

В итоге проведенной работы описаны две группы генов, связанных с ранее неизвестными путями контроля продолжительности жизни. Первая группа представлена генами, кодирующими белки, необходимые для биосинтеза катехоламинов и передачи нервного импульса в нейронах (Catecholamines up, Dopa decarboxylase, Diphenol oxidase A2), вторую группу составляют гены, кодирующие транскрипционные факторы РНК-полимеразы II, которые участвуют в контроле развития и функционирования мотонейронов (shuttle craft, tail up, Lim3, crooked legs, escargot).

Практическая значимость. Полученные данные могут быть использованы при чтении курсов лекций по генетике и геронтологии в высших учебных заведениях, а также в биомедицинских исследованиях, при изучении генетического контроля продолжительности жизни и ряда болезней человека, включая неврологические, когда причиной патологии являются нарушения развития клеток нервной системы.

Апробация работы. Результаты, полученные в данной работе, были представлены на следующих научных семинарах и конференциях: на американских ежегодных конференциях по генетике дрозофилы (Сан-Диего, США, 2002, 2008); на 4-ом съезде российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, Россия, 2008); 20-ом международном генетическом конгрессе (Берлин, Германия, 2008); на конкурсах работ молодых учёных на соискание стипендий фонда «Будущее молекулярной генетики» (Москва, Россия, 2005, 2007).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 4 работы в международных реферируемых изданиях.

Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста и включает следующие главы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы. Диссертация содержит 20 таблиц, 18 рисунков и 182 литературные ссылки.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Работа состоит из двух частей: 1) поиск новых генов, контролирующих продолжительность жизни; 2) выбор наиболее интересных из найденных генов, окончательное доказательство их участия в контроле продолжительности жизни, а также исследование характера их влияния на изучаемый признак.

Выявление новых генов, участвующих в контроле продолжительности жизни

Первая часть работы заключалась в поиске генов, аллели которых в двух изогенных лабораторных линиях дрозофилы дикого типа (2b и Oregon) по-разному влияют на продолжительность жизни. Ранее рекомбинационное картирование позволило выявить 5 крупных фрагментов генома, потенциально содержащих гены, различные аллели которых обусловливают разную продолжительность жизни (Nuzhdin et al., 1997; Vieira et al., 2000; Leips, Mackay, 2000, 2002). Далее, для уточнения локализации генов, влияющих на продолжительность жизни, до сравнительно небольших районов генома были использованы количественные комплементационные тесты с перекрывающимися делециями, расположенными внутри районов, выявленных с помощью рекомбинационного картирования. Делеционное картирование было начато ранее (Pasyukova et al., 2000) и продолжено в ходе выполнения данной работы. Наконец, для выявления генов-кандидатов, участвующих в контроле продолжительности жизни, в данной работе были проведены количественные комплементационные тесты с мутациями ряда генов, локализованных в выявленных с помощью делеционного картирования небольших районах генома.

Суть количественных комплементационных тестов с делециямии и мутациями заключается в следующем. Мы исследовали небольшие различия в продолжительности жизни, обусловленные тем, что в линиях 2b и Oregon присутствуют различные аллели генов-кандидатов, контролирующих этот признак. Следовательно, нас интересовали те случаи, когда фенотипическая разница между аллелями гена-кандидата в двух исследуемых линиях заметна на фоне делеции (Df), захватывающей район его локализации, или мутантного аллеля (mut), но незаметна на фоне хромосомы без делеции и на фоне аллеля дикого типа. Каждая использованная в работе делеция и мутация поддерживалась в линии на фоне хромосомы-балансера (Bal), не содержащей делеций и мутаций генов-кандидатов. Таким образом, в комплементационном тесте с делециями нас интересовали те случаи, когда (mut2b/Df – mutOregon/Df) (mut2b/Bal – mutOregon/Bal), а в комплементационном тесте с мутациями – (mut2b/mut – mutOregon/mut) (mut2b/Bal – mutOregon/Bal).

Для проведения комплементационных тестов с делециямии (мутациями) мы скрещивали мух из линий Ore и 2b c мухами из линий с делециями (мутациями). В потомстве каждого скрещивания в течение дня отбирали по 20 девственных особей каждого пола и генотипа (mut2b/Df, mutOregon/Df, mut2b/Bal и mutOregon/Bal) и помещали в пробирки по 5 штук, самок и самцов отдельно, на стандартный корм для измерения продолжительности жизни. Делеции одного района и мутации одного гена исследовали одновременно. Количество живых мух в пробирке регистрировали каждый день. Продолжительность жизни определяли как число прожитых данной особью дней. Оставшихся в живых мух пересаживали на свежий корм каждые 5-7 дней. Все культуры и скрещивания вели при 25оC.

Для анализа данных о продолжительности жизни самцов (самок) четырех генотипов, появляющихся в потомстве от скрещивания 2b и Oregon с каждой из линий с делецией или мутацией, мы использовали двухфакторный дисперсионный анализ, рассматривая в качестве фиксированных главных факторов Линию (Л, 2b или Oregon) и Генотип (Г, делеция Df, мутация mut или балансер Bal). Достоверность взаимодействия двух факторов, Л*Г, то есть справедливость неравенств (mut2b/Df – mutOregon/Df) (mut2b/Bal – mutOregon/Bal) и (mut2b/mut – mutOregon/mut) (mut2b/Bal – mutOregon/Bal) служила указанием на некомплементарность, то есть на то, что ген, мутация в котором используется в опыте, имеет в линиях 2b и Oregon аллели, по-разному влияющие на продолжительность жизни. Однако, с учетом неоднородности генетического фона в наших опытах, достоверность Л*Г может быть объяснена не только аллельными, но и эпистатическими взаимодействиями. В связи с этим дополнительным критерием для отбора случаев аллельного взаимодействия служило соблюдение неравенства mut2b/Df – mutOregon/Df 0 при mut2b/Bal – mutOregon/Bal = 0 и соблюдение неравенства mut2b/mut – mutOregon/mut 0 при mut2b/Bal – mutOregon/Bal = 0. В этом случае аллели гена-кандидата, присутствующие в линиях 2b и Oregon, демонстрировали достоверные различия по продолжительности жизни на фоне делеции или мутантного аллеля этого гена и отсутствие этих различий на фоне хромосомы и аллеля дикого типа. Линии 2b и Oregon не отличаются по продолжительности жизни, поэтому мы рассматривали достоверность фактора Л как указание на некомплементарность, при условии соблюдения дополнительного критерия, описанного выше. В тех случаях, когда в работе были использованы несколько мутаций одного гена, трехфакторный дисперсионный анализ, отдельно для самцов и самок, проводили также для всей совокупности данных, касающихся этого гена, рассматривая в качестве главных фиксированных факторов Линию, Генотип и Мутацию. Достоверность факторов Л и Л*Г рассматривали как указание на некомплементарность, при условии соблюдения дополнительного критерия. Во всех случаях в качестве стандартного значения порога достоверности использовали P<0,05.

Мы провели делеционное картирование двух районов, 36В;38В и 6Е;10D, используя линии с делециями, полученные из коллекционного центра культур дрозофилы в Блумингтоне (США) и из европейского центра культур дрозофилы в Умее (Швеция).

Pages:     || 2 | 3 | 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»