WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 ||

На рис. 3 представлены продукты амплификации кДНК гена Oct4 клеточных гибридов после обработки ферментом PstI. Фрагмент размером 312 пн соответствует аллелю M. musculus, тогда как фрагмент 254 пн соответствует аллелю M. caroli. Выявлено, что в 12 клонах содержащих хромосому 17 M. caroli наблюдается экспрессия аллеля соматического партнера.

На рис. 4 представлены результаты ОТ-ПЦР-анализа экспрессии аллелей M. caroli и M. musculus гена Nanog в клонах НМС. Фрагмент размером 148 пн маркирует транскрипт аллеля M. caroli, тогда как фрагмент 101 пн аллель M. musculus. Из приведенной иллюстрации видно, что во всех клонах гибридных клеток содержащих хромосому 6 M. caroli имеет место экспрессия аллеля соматического партнера гена Nanog.

Рис. 4. Результаты ОТ-ПЦР-анализа экспрессии аллелей M. caroli и M. musculus гена Nanog в гибридных клетках серии НМС и ЭСК НМ1. Присутствие ПЦР продукта размером 101 пн маркирует транскрипт аллеля M. musculus, а 148 пн экспрессию аллеля M. caroli. (рисунок предоставлен студентом-дипломником НГУ Н.Р. Баттулиным)

Рис. 5. Результаты ОТ-ПЦР-анализа экспрессии аллелей M. caroli и M. musculus гена Gla в гибридных клетках серии НМС и ЭСК НМ1. Присутствие ПЦР продукта размером 220 пн маркирует транскрипт аллеля M. musculus, а 174 пн экспрессию аллеля M. caroli. (рисунок предоставлен студентом-дипломником НГУ Н.Р. Баттулиным)

На рис. 5 представлена электрофореграмма продуктов амплификации кДНК гена Gla клеточных гибридов после обработки ферментом HinfI. Фрагмент размером 220 пн маркирует транскрипты аллеля M. musculus, фрагмент 174 пн  аллеля M. caroli. Проведенный анализ показал присутствие транскриптов аллеля M. caroli гена Gla во всех исследованных клонах.

Поскольку гены Oct4, Nanog и Gla были неактивны в геноме спленоцитов, то перечисленные выше факты свидетельствуют об их реактивации. Важно отметить, что даже в клоне HMC6, в котором, повидимому, уровень экспрессии генов Oct4 и Nanog снижен по сравнению и с остальными клонами, и родительской линией ЭСК HM1, выявляются транскрипты M. caroli Oct4 и Nanog. На основании полученных данных можно предположить, что при взаимодействии с геномом ЭСК генома дифференцированной клетки (спленоцит) происходит его репрограммирование.

Инактивация Ххромосомы при индуцированной in vitro дифференцировке гибридных клонов серии HMC.

Инактивация Х-хромосом у естественных гибридов F1, полученных от скрещивания M. musculus с M. caroli, происходит случайным и равновероятным способом, то есть количество клеток с активной Х-хромосомой M. musculus и M. caroli примерно одинаково (Chapman, Shows, 1976). Известно, что в гибридных клетках, полученных слиянием ЭСК генотипа ХУ с соматическими клетками генотипа ХХ или ХУ, Ххромосомы находятся в активном состоянии (Matveeva et al., 1998; Tada et al. 2001). Также известно, что гибридные клетки, так же как и ЭСК, способны образовывать in vitro эмбриоидные тельца (ЭТ), в которых активно происходят процессы дифференцировки, включая инактивацию одной из Х-хромосом (Rastan, Robertson, 1985; Matveeva et al., 1998).

При слиянии клеток НМ1 M. musculus генотипа ХУ со спленоцитами взрослой самки M. caroli в гибридной клетке ожидается присутствие 3-х Ххромосом, две из которых принадлежат M. caroli и одна M. musculus. Однако анализ соотношения родительских Ххромосом в клонах гибридных клеток (Пузаков и др., 2007) с помощью «двуцветной» гибридизации in situ, показал, что в большинстве изученных клонов клетки содержали две Ххромосомы, одну M. musculus и другую M. caroli. Учитывая эти данные, мы отобрали 5 гибридных клонов, в которых содержание двух родительских Ххромосом в большинстве клеток было близким к 1:1, и индуцировали их дифференцировку in vitro. Такой подход позволяет выяснить случайно или неслучайно происходит инактивация Ххромосом, различавшихся своим онтогенетическим статусом до момента образования гибридных клеток.

Для того чтобы охарактеризовать процесс инактивации Ххромосом в ЭТ мы использовали два маркерных гена Gla и Xist, первый является маркером активной Ххромосомы, (активен только ЭСК (Adler et al., 1977), в спленоцитах он неактивен (Freeman et al., 1998)), тогда как второй является не только маркером неактивной Х-хромосомы, но ключевым элементом самого процесса инактивации. Для дискриминации транскриптов родительских аллелей генов Gla и Xist был использован обнаруженный Баттулиным Н.Р. рестрикционный полиморфизм между M. musculus и M. caroli (рис. 2). Аллели гена Gla у M. musculus и M. caroli (GenBank Ac. No. DQ218140) различаются наличием сайта для эндонуклеазы рестрикции HinfI у M. caroli. Аллель гена Xist (GenBank Ac. No. DQ218138) M. caroli отличается от M. musculus наличием сайта для эндонуклеазы рестрикции DraI у M. musculus.

Предложенный метод является более масштабным тестом для оценки репрограммирования, нежели реактивация отдельных генов, поскольку инактивация хотя и оценивается на уровне отдельных генов, но характеризует состояние целой хромосомы.

Анализ транскрипции родительских аллелей генов Xist и Gla проводился в эмбриоидных тельцах ЕВ1, ЕВ28, ЕВ29, ЕВ41 и ЕВ56, полученных из суспензионных культур гибридных клонов НМС1, НМС28, НМС29, НМС41 и НМС56, соответственно (рис. 6, 7). На рис. 6 представлены результаты ОТ-ПЦР анализа экспрессии гена Xist в ЭТ. Показано, что экспрессия гена Xist обнаруживается во всех ЭТ и существенно выше, чем в клетках НМ1. Обработка ферментом DraI продуктов амплификации с кДНК гена Xist выявила экспрессию обоих аллелей этого гена во всех исследованных ЭТ. Судя по визуальной оценке, соотношение транскриптов обоих аллелей соответствует примерно 1:1, без признаков преобладания какого-либо из них.

Рис. 6. Экспрессия аллелей M. caroli и M. musculus гена Xist в ЭТ: EB1, EB28, EB29, EB41, EB56, образовавшихся из клеток клонов НМС1, НМС28, НМС29-3, НМС41 и НМС56 и из ЭСК НМ-1. "-" – без обработки ПЦР продуктов рестриктазой DraI; "+" – после обработки ПЦР продуктов рестриктазой DraI; L100 – маркер с шагом 100 пн. Присутствие ПЦР продукта размером 250 пн маркирует транскрипт аллеля M. caroli, а 153 пн – аллеля M. musculus.

Рис. 7. Результаты ОТ-ПЦР-анализа транскрипции аллелей гена Gla в гибридных клонах НМС1, НМС28, НМС29-3, НМС41 и НМС46 и в ЭТ (EB1, EB28, EB29, EB41), образовавшиеся из клеток этих клонов. Присутствие ПЦР продукта размером 220 пн маркирует активность аллеля M. musculus, а 174 пн экспрессию аллеля M. caroli; фрагмент 98 пн образуется при обработке HinfI ПЦР продуктов обоих аллелей. L100 – молекулярный маркер с шагом 100 пн.

При анализе экспрессии гена Gla транскрипты этого гена были обнаружены в пяти исследованных клонах гибридных клеток, в ЭТ, полученных из них, и в ЭСК, тогда как в спленоцитах они отсутствовали (рис. 7). Обработка продуктов ОТ-ПЦР эндонуклеазой рестрикции HinfI показала, что и в исследованных гибридных клетках и в полученных из них ЭТ наблюдается высокая активность обоих родительских аллелей гена Gla и (по визуальной оценке) примерно в равном соотношении.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о случайной инактивации Ххромосом M. musculus и M. caroli в гибридных клетках, несмотря на первоначальные эпигенетические различия родительских хромосом, при индуцированной дифференцировке in vitro. Предположительно это может быть результатом «стирания» эпигенетических различий под действием факторов генома плюрипотентного партнера.

ВЫВОДЫ

1. В клонах гибридных клеток серии НМС, полученных слиянием эмбриональных стволовых клеток M. musculus со спленоцитами взрослой самки M. caroli, показано присутствие маркеров, свойственных недифференцированным эмбриональным клеткам: активность щелочной фосфатазы и присутствие эмбрионального антигена ЕСМА7. По активности щелочной фосфатазы выявлены межклональные различия, возможно обусловленные присутствием разного числа хромосом соматического партнера.

2. Установлено, что клон гибридных клеток, содержащий единичные хромосомы M. caroli, и клон с высоким содержанием хромосом M. caroli способны участвовать в формировании тканей и органов химерных животных, что является свидетельством сохранения ими плюрипотентности и, более того, доминирования этого свойства у гибридных клеток.

3. В клонах гибридных клеток показана экспрессия генов-маркеров плюрипотентности Nanog и Oct4 и реактивация аллелей генов Oct4, Nanog и Gla M. caroli, неактивных в геноме спленоцитов.

4. Анализ экспрессии генов Gla и Xist в гибридных клетках после индуцированной дифференцировки их in vitro показал отсутствие признаков предпочтительной инактивации Х-хромосом, имеющих разную «онтогенетическую историю».

5. Полученные данные свидетельствуют, что клоны гибридных клеток серии НМС сохраняют плюрипотентные свойства на уровне сходным с ЭСК, то есть плюрипотентность проявляется у гибридных клеток как доминантный признак. Однако в некоторых клонах, такие как НМС6 и НМС44, имеются признаки снижения их потенциала и повышенная склонность к дифференцировке.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Серов О.Л., Матвеева Н.М., Кизилова Е.А., Кузнецов С.Б., Железова А.И., Голубица А.Н., Пристяжнюк И.Е., Пузаков М.В. «Хромосомная память» родительских геномов в эмбриональных гибридных клетках. // Онтогенез, 2003, Т. 34, № 3, С. 216-227.

2. Пузаков М.В., Баттулин Н.Р., Темирова С.А., Матвеева Н.М., Сердюкова Н.А., Графодатский А.С., Серов О.Л. Анализ экспрессии родительских аллелей Xist и Gla в межвидовых эмбриональных гибридных клетках в условиях индуцированной in vitro инактивации Х-хромосом. // Онтогенез, 2007, Т. 38, № 2, С. 1-8.

3. Vasilkova A.A., Kizilova H.A., Puzakov M.V., Shilov A.G., Zhelezova A.I., Golubitsa A.N., Battulin N.R., Vedernikov V.E., Menzorov A.G., Matveeva N.M., Serov O.L. Dominant manifestation of pluripotency in embryonic stem cell hybrids with various numbers of somatic chromosomes. // Mol. Reprod. Dev., 2007, V. 74, № 8, P. 941-951.

4. Серегин А.В., Пузаков М.В., Мензоров А.Г. Сегрегация хромосом во внутривидовых и межвидовых клеточных гибридах, полученных от слияния эмбриональных стволовых и соматических клеток мыши и анализ их плюрипотентности. // Материалы XL Международной научной студенческой конференции, Биология. Новосиб. гос. университет., Новосибирск, 2002, С. 101-103.

5. Пузаков М.В., Кизилова Е.А. Разработка метода количественной оценки плюрипотентности эмбриональных стволовых клеток и их гибридов в условиях in vitro. // III международная научная конференция молодых ученых и студентов, Казахский национальный университет им. аль-Фараби, Алматы, 2003, С. 186-187.

6. Пузаков М.В., Кизилова Е.А., Матвеева Н.М., Шилов А.Г., Мензоров А.Г., Василькова А.В., Серов О.Л. In vitro-анализ плюрипотентности клеточных гибридов, полученных от слияния эмбриональных стволовых клеток и спленоцитов мыши. // Цитология, 2003, Т. 45, № 9, С. 917-918.

7. Серов О.Л., Матвеева Н.М., Кизилова Е.А., Кузнецов С.Б., Железова А.И., Голубица А.Н., Пристяжнюк И.Е., Петракова О.С., Темирова С.А., Пузаков М.В. «Онтогенетическая память» родительских хромосом в гибридах, полученных от слияния эмбриональных стволовых клеток и спленоцитов взрослого животного. // Цитология, 2003, Т. 45, № 9, С. 926.

8. Пузаков М.В., Василькова А.А., Матвеева Н.М., Серов О.Л. Сравнение плюрипотентности межвидовых клеточных гибридов, полученных от слияния эмбриональных стволовых клеток и спленоцитов мыши. // Труды 3-го съезда ВОГиС, Москва, 6-12 июня 2004, Т.2, С.403.

9. Матвеева Н.М., Пристяжнюк И.Е., Пузаков М.В., Мензоров А.Г., Василькова А.А., Голубица А.Н., Железова А.И., Темирова С.А., Серов О.Л. Эмбриональные стволовые гибридные клетки – модель для изучения контроля плюрипотентности в условиях in vitro. // Материалы Международного симпозиума, Санкт-Петербург. Цитология, 2004, Т.46, № 10, С.927.

10. Баттулин Н.Р., Пузаков М.В. Анализ экспрессии родительских аллелей генов Nanog, Oct4, Gla, Xist и Lmna в межвидовых гибридных клетках. // Материалы XLIV Международной научной студенческой конференции, Биология, Новосиб. гос. университет, Новосибирск, 2006, С. 112.

11. Василькова А.А., Кизилова Е.А., Пузаков М.В., Баттулин Н.Р., Шилов А.Г., Железова А.И., Голубица А.Н., Мензоров А.Г., Матвеева Н.М., Серов О.Л. Полное доминирование эмбрионального генома в гибридных клетках индуцирует восстановление потенций (репрограммирование) дифференцированных клеток. // Материалы международной конференции «Фундаментальные науки – биотехнологии и медицине», Новосибирск, 2006, С. 16.

12. Пузаков М.В., Баттулин Н.Р. и Серов О.Л. Изучение репрограммирования Ххромосом спленоцитов в геноме эмбриональных гибридных клеток. // Цитология, 2006, Т. 48, № 9. С. 795.

13. Мензоров А.Г., Ведерников В.Е., Пузаков М.В., Василькова А.А., Шилов А.Г., Кизилова Е.А., Серов О.Л. Сохранение маркеров хромосом соматического партнера в геноме внутри- и межвидовых эмбриональных гибридных клеток мыши в условиях дифференцировки in vivo. // Цитология, 2006, Т. 48, № 9. С. 780-781.

Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 ||






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»