WWW.DISSERS.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

загрузка...
   Добро пожаловать!

Pages:     | 1 | 2 || 4 |

-

+

-

-

толстая кишка

+

-

-

-

-

+

нт

+

-

-

+

+

тонкая кишка

+

+

нт

-

-

глаз

+

+

-

+

+

+

+

+

-

+

+

+

скелетная мускулатура

+

-

-

-

-

+

-

+

+

-

+

+

кожа

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

"+" - присутствие маркера донорских клеток

"-" - отсутствие маркера донорских клеток

"нт" - анализ не проводился.

В таблице 2 представлены суммарные результаты анализа вклада клеток линии НМ1 и гибридов серии НМС в различные ткани и органы химерных животных. Этот вклад оценивали с помощью нескольких маркеров. Благодаря тому, что линия мышей 129/Ola (клетки НМ-1) и линия C57Bl/J6 (реципиентная линия мышей) имеют разные изоформы ГФИ, стало возможным выявлять вклад донорских клеток в органы химерных животных с помощью электрофоретического разделения в крахмальном геле. В связи с различной длиной микросателлита D9Mit181 маркирующего хромосому 9 у линии мышей 129/Ola и линии C57Bl/J6, мы так же могли качественно показать вклад клеток в органы химер. Однако оба эти маркера выявляют присутствие потомков гибридных клеток только по наличию генома ЭСК НМ-1, тогда как используемые видоспецифичные маркеры хромосомы 19 (ген Catsper1) и Ххромосомы (ген Gla) выявляют присутствие генетического материала мыши M. caroli. По данным, полученным Баттулиным Н.Р. последовательности фрагментов гена Gla мыши M. caroli (GenBank Ac. No. DQ218140) и M. musculus, а так же последовательности фрагментов гена Catsper1 M. caroli (GenBank Ac. No. DQ021499) и M. musculus имеют различия. На основе этих различий были созданы праймеры, которые позволили селективно амплифицировать фрагмент размером 255 пн гена Gla M. caroli и фрагмент размером 132 пн гена Catsper1 M. caroli.

Рис. 1. Вклад потомков клеточных гибридов в органы и ткани химерных животных. А - химера #9 (донор клеток клон НМС15): 1 - семенники; 2 - селезенка; 3 - почка; 4 - печень; 5 - сердце; 6 - контроль, линия мышей С57Bl/J; 7 - контроль, линия клеток НМ-1; 8 - икроножная мышца; 9 – головной мозг. Б - химера #3 (донор клеток клон НМС29): 1 - семенники; 2 - селезенка; 3 - почка; 4 - печень; 5 – контроль, линия клеток НМ-1; 6 – контроль, линия мышей С57Bl/J; 7 - сердце; 8 - мозг; 9 - кишечник; 10  скелетная мускулатура (икроножная мышца).

Для химеры, полученной с участием клеток клона НМС15, с помощью микросателлита D9Mit181 показан вклад во все органы, при этом выявлялся только продукт, специфичный для родительской линии клеток НМ1. По результатам электрофоретического анализа аллельных вариантов ГФИ присутствие потомков клеток клона НМС15 выявлено во всех исследованных органах химерного животного (рис. 1, А). По визуальной оценке, вклад гибридных клеток примерно равен вкладу клеток реципиентного эмбриона. Анализ химеры с помощью маркера Ххромосомы M. caroli гена Gla не выявил присутствие этого маркера ни в одном органе. Можно предположить, что это животное образовалось с участием клеток НМ1, которые в некотором количестве могли сохраниться в исходном клоне НМС15 при селективных условиях за счет кооперативного эффекта (Hooper et al., 1982). Соответственно, высокий вклад потомков клеток гибридного клона НМС15 в формирование химерного животного можно также объяснить участием НМ1 клеток.

Субклоны НМС151 и НМС154, также как и исходный клон НМС15, имели околотетраплоидный набор хромосом (И.Е. Пристяжнюк, личное сообщение), и содержали 2 и 1 гомеолога M. caroli, соответственно, а также небольшую долю околодиплоидных клеток. Однако происхождение субклонов НМС151 и НМС154 из единичных клеток клона НМС15 полностью исключало присутствие в них клеток родительской линии НМ1, то есть все клетки субклонов имеют гибридное происхождение. У всех полученных химерных животных вклад потомков клеток субклонов по окраске шерсти (515%) значительно снизился в сравнении с контрольной линией ЭСК и с исходным клоном НМС15 (30-50%). Вклад в органы и ткани потомков клеток субклона НМС154 по биохимическому и молекулярным маркерам оказался также несколько меньше (не был выявлен вклад в селезенку, печень, легкие) по сравнению с контрольной линией ЭСК и с исходным клоном НМС15 (табл. 2). Тем не менее, клетки субклона НМС154 дают вклад во все три зародышевых листка, но со сниженным вкладом в производные энтодермы. Вклад субклона НМС151 в формировании химер по тем же оценкам оказался более снижен относительно НМС15-4. Для химер, полученных с участием клеток субклона НМС151, показан вклад гибридных клеток в формирование лишь 5ти органов. Такое снижение химеризма возможно связано не только с присутствием хромосом M. caroli и гибридным происхождением клеток, но и с селекцией в процессе развития в пользу диплоидных клеток ВКМ реципиентной бластоцисты по отношению к клеткам субклонов с высокой плоидностью (Everett, West, 1996, 1998).

Вклад потомков клеток гибридного клона НМС29 был ограничен по сравнению с родительской линией НМ-1, с клоном НМС15 и с субклоном НМС154. По результатам электрофоретического разделения ГФИ вклад выявлен только в нескольких органах: семенник, сердце, мозг, кишечник (рис. 1, Б), а ПЦР анализ с видоспецифичными маркерами показал вклад в 7-ми из 12-ти органов (табл. 2). Возможно, что наличие большого количества хромосом мыши M. caroli ограничивает потенциал клеток клона НМС29, что проявляется как снижение химеризма по окраске шерсти и по вкладу в отдельные ткани. Однако если оценивать по закладкам, то потомки клеток клона НМС29 дают вклад во все три зародышевых листка, хотя вклад в производные энтодермы очень низкий (табл. 2).

Особо следует отметить, что, несмотря на выявленное присутствие потомков гибридных клеток в гонадах, их прохождение через зародышевый путь установлено не было, так как не было получено потомства химерных животных с генами от донорских клеток. Возможно, это связано с накопленными хромосомными перестройками у ЭСК линии НМ-1 в процессе пассирования, или с несбалансированностью набора хромосом у клонов НМС15 и НМС29, и субклонов НМС15-1 и НМС15-4.

Данные о вкладе клеток клонов в формирование органов химер свидетельствуют о том, что гибридные клетки сохраняют плюрипотентность. Важным отличием данной работы от предшествующих является то, что был проведен частичный анализ хромосомного состава химерных животных, полученных из эмбриональных гибридных клеток. Для корректной оценки потенциала гибридных клеток необходимо быть уверенным, что химерные животные произошли именно из клеток, имеющих хромосомы соматического партнера. Нами показано, что маркеры, по крайней мере, 2-х хромосом соматического партнера не элиминируются. Это свидетельствует о том, что в процессе развития химерного животного, когда снимается селективное давление факторов использованных при получении гибридных клеток (ГАТ), и в то же время включаются механизмы клеточной селекции связанные с несбалансированностью генома гибридных клеток или повышенной плоидностью, доля потомков клеточных гибридов с хромосомами соматического партнера достаточно велика.

В целом, полученные данные о вкладе гибридных клеток в формировании химер показали, что клоны с разным числом хромосом соматического партнера (спленоцитов), от 1-3 в клоне НМС15 и его субклонах до 13 хромосом в клоне НМС29, имеют сходный уровень плюрипотентности, который, в свою очередь, сопоставим с таковым родительских клеток НМ-1. Эти данные свидетельствуют о том, что плюрипотентность проявляется у гибридных клеток как доминантный признак. Следует также отметить, что этот вывод получил подтверждение в недавних исследованиях в лаборатории генетики развития, где удалось получить серию химерных животных в опытах по инъекции гибридных клеток типа ЭСК-фибробласт (Е.А. Кизилова, личное сообщение) и имевших околотетраплоидный кариотип. Более того, микросателлитный анализ показал, что все хромосомы фибробластного происхождения присутствовали в гибридных клетках ЭСК-фибробласт (А.А. Круглова, личное сообщение).

Анализ экспрессии «генов плюрипотентности» Oct4 и Nanog в гибридных клетках.

Еще одним способом оценки плюрипотентности является анализ экспрессии генов Oct4 и Nanog. Эти гены активны только в раннем эмбриональном развитии и являются ключевыми в поддержании плюрипотентных свойств, наличие их экспрессии свидетельствует о сохранении плюрипотентности в гибридных клетках. Анализ экспрессии гена Oct4 показал, что во всех клонах серии HMC выявляются транскрипты этого гена, хотя следует отметить, что в клонах НМС6 и НМС44 уровень его экспрессии низкий. Анализ экспрессии другого молекулярного маркера «плюрипотентности» – гена Nanog показал, что во всех клонах серии НМС присутствуют его транскрипты. Однако в клоне НМС6 уровень экспрессии этого гена заметно снижен.

Предполагаемое снижение уровня экспрессии генов Oct4 и Nanog в некоторых клонах согласуется с их повышенной склонностью к дифференцировке, так что, по-видимому, большинство клеток этих клонов находится на начальных этапах дифференцировки и лишь небольшая доля клеток обладает плюрипотентными свойствами и экспрессирует Oct4 и Nanog.

Сравнение экспрессии родительских аллелей генов Oct4, Nanog и Gla в гибридных клетках.

Для дискриминации транскриптов аллелей генов Oct4, Nanog и Gla, экспрессирующиеся в ЭСК и в спленоцитах альтернативным образом, был использован рестрикционный полиморфизм между аллелями родительских видов. При сравнении последовательностей фрагментов генов Oct4 (GenBank Ac. No. DQ250732), Nanog (GenBank Ac. No. DQ250731) и Gla (GenBank Ac. No. DQ218140) M. caroli с гомологичными последовательностями M. musculus были выявлены видоспецифичные сайты рестрикции (рис. 2) (по данным, полученным Н.Р. Баттулиным).

Рис. 2. Различия аллелей генов Oct4, Nanog, Gla и Xist мышей M. caroli и M. musculus.

Рис. 3. Результаты ОТ-ПЦР анализа экспрессии аллелей M. caroli и M. musculus гена Oct4 в ЭСК НМ-1 и гибридных клетках серии НМС. L – маркер с шагом 100 нп.

Pages:     | 1 | 2 || 4 |






© 2011 www.dissers.ru - «Бесплатная электронная библиотека»